Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка методики поиска, получение и тестирование активности новых ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы на основе низкомолекулярных соединений, пептидов, белков и некодирующих нуклеиновых кислот

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.0771
Организация
ИМГ РАН

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Кульбачинский Андрей Владимирович

Этапы проекта

1
12.04.2010 - 20.06.2010
1.1. Выбор и обоснование принятого направления исследований.
1.2. Получение препаратов РНК-полимераз различных Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий (в том числе, Escherichia coli, Xanthomonas oryzie, Bacillus subtilis, Thermus aquaticus, Deinococcus radiodurans) для тестирования активности различных ингибиторов транскрипции. Получение препаратов мутантных вариантов бактериальных РНК-полимераз.
1.3. Разработка набора тестов, позволяющих анализировать действие ингибиторов РНК-полимеразы на узнавание промоторов, инициацию синтеза РНК, уход РНК-полимеразы с промотора, элонгацию и терминацию транскрипции in vitro.
1.4. Получение образцов бактериофагов Т7, Eco32, Т5 и Xp10, заражающих грам-отрицательные бактерии (Escherichia coli и Xanthomonas oryzie).
1.5. Отработка методики выделения белков бактериофагов Т7, Eco32, Т5 и Xp10, взаимодействующих с РНК-полимеразой, из клеток бактерий-хозяев.
1.6 Проведение патентных исследований
Развернуть
2
21.06.2010 - 01.11.2010
2.1. Выделение и идентификация белков бактериофагов Т7, Eco32, Т5 и Xp10, связывающихся с РНК-полимеразами бактерий-хозяев (Escherichia coli и Xanthomonas oryzae).
2.2. Получение препаратов природных некодирующих РНК (в том числе, различных вариантов 6S РНК) и однонитевых ДНК (на основе ориджинов репликации нитчатых бактериофагов), связывающихся с бактериальной РНК-полимеразой.
2.3. Проведение отбора однонитевых ДНК-аптамеров, связывающихся во вторичном канале кор-фермента РНК-полимеразы Escherichia coli. Анализ последовательностей аптамеров и характеристика их связывания с РНК-полимеразой.
2.4. Получение аптамеров, взаимодействующих с сигма-субъединицами РНК-полимераз Escherichia coli и Thermus aquaticus, и характеристика их связывания с сигма-субъединицами и холоферментами РНК-полимераз.
2.5. Получение образцов новых бактериофагов, заражающих бактерии родов Pseudomonas и Xanthomonas (в том числе, патогенные виды).
2.6. Определение полной геномной последовательности новых бактериофагов, заражающих бактерии родов Pseudomonas и Xanthomonas.
Развернуть
3
01.01.2011 - 31.05.2011
3.1. Получение рекомбинантных препаратов белков бактериофагов Т7, Eco32, Т5 и Xp10, связывающихся с РНК-полимеразой. Анализ связывания полученных белков с РНК-полимеразами разных бактерий.
3.2. Исследование влияния рекомбинантных белков бактериофагов на активность бактериальной РНК-полимеразы in vitro и выявление белков-ингибиторов транскрипции.
3.3. Анализ механизмов подавления активности РНК-полимеразы белками бактериофагов-ингибиторами транскрипции.
3.4. Исследование влияния природных некодирующих РНК и однонитевых ДНК, а также их различных производных, на активность РНК-полимераз различных бактерий in vitro. Анализ механизмов подавления активности РНК-полимеразы выявленными ингибиторами на основе природных некодирующих нуклеиновых кислот.
3.5. Изучение действия аптамеров, связывающихся во вторичном канале бактериальной РНК-полимеразы, на процессы инициации, элонгации и терминации транскрипции in vitro. Анализ механизмов подавления активности РНК-полимераз разных бактерий выявленными аптамерами-ингибиторами транскрипции.
3.6. Изучение действия аптамеров, взаимодействующих с сигма-субъединицей бактериальной РНК-полимеразы, на связывание сигма-субъединицы с кор-ферментом и процесс инициации транскрипции in vitro. Анализ механизмов подавления узнавания промоторов и инициации транскрипции выявленными аптамерами-ингибиторами.
Развернуть
4
01.06.2011 - 01.11.2011
4.1. Идентификация сайтов связывания с РНК-полимеразой охарактеризованных ранее белков-ингибиторов, кодируемых бактериофагами Т7, Eco32, Т5 и Xp10, с использованием набора РНК-полимераз, содержащих мутации в различных районах, а также при помощи методов белок-белковых сшивок с последующей масс-спектрометрией.
4.2. Характеристика молекулярной структуры сайтов связывания ингибиторов бактериальной РНК-полимеразы на основе природных и синтетических некодирующих нуклеиновых кислот с использованием набора мутантных РНК-полимераз и методов ДНК-белковых сшивок.
4.3. Создание коллекции второго поколения мутантных вариантов лассо-пептида микроцина J25, связывающихся во вторичном канале кор-фермента РНК-полимеразы. Выделение мутантных вариантов микроцина J25. Анализ действия полученных вариантов микроцина на активность бактериальной РНК-полимеразы in vitro и на рост бактерий in vivo.
4.4. Анализ действия лассо-пептида капиструина на РНК-полимеразы Pseudomonas и других видов бактерий, а также анализ антимикробного действия капиструина in vivo.
4.5. Анализ действия других охарактеризованных на сегодняшний день лассо пептидов (аборицин, сиамицины, Res-501) на активность РНК-полимераз различных бактерий in vitro и на рост клеток бактерий in vivo.
4.6. Масс-спектрометрический анализ продуктов белок-белковых сшивок в экспериментах по идентификации сайтов связывания белков-ингибиторов с РНК-полимеразой.
4.7. Приготовление препаратов лассо-пептидов (микроцин, капиструин, аборицин, сиамицины, Res-501) и их различных производных.
Развернуть
5
01.01.2012 - 31.05.2012
5.1. Выделение и идентификация белков бактериофагов Xanthomonas Xp12, Pseudomonas PA29 и E. coli PhiEcoM-GJ1, связывающихся с РНК-полимеразами бактерий-хозяев.
5.2. Анализ действия выделенных белков бактериофагов на активность РНК-полимераз различных бактерий на разных стадиях транскрипции.
5.3. Проведение биоинформатического поиска генных кластеров, потенциально кодирующих лассо-пептиды, в геномных последовательностях различных видов бактерий.
5.4. Клонирование генных кластеров, которые, на основании биоинформатических предсказаний, могут кодировать лассо пептиды.
5.5. Гетерологическая экспрессия продуктов генных кластеров, доказательство синтеза и структуры лассо-пептидов методами масс-спектрометрии и протеомики.
5.6. Анализ антимикробного действия новых лассо-пептидов in vivo и их действия на бактериальную РНК-полимеразу in vitro.

5.7. Секвенирование последовательности генных кластеров, потенциально кодирующих лассо-пептиды.
5.8. Масс-спектрометрический анализ продуктов генных кластеров, кодирующих лассо-пептиды.
5.9. Синтез генов, кодирующих рекомбинантные лассо-пептиды, для создания генетических конструкций с оптимизированным уровнем синтеза в E. coli.
Развернуть
6
01.06.2012 - 01.11.2012
6.1. Разработка методики поиска низкомолекулярных соединений-ингибиторов РНК-полимеразы, основанной на конкуренции с флуоресцентно-мечеными аптамерами, природными РНК- и ДНК-лигандами РНК-полимеразы и белками бактериофагов.
6.2. Разработка методики поиска низкомолекулярных соединений-ингибиторов инициации транскрипции на основе флуоресцентно-меченых ДНК-матриц, взаимодействующих с РНК-полимеразой.
6.3. Разработка методики картирования участков связывания ингибиторов с РНК-полимеразой с использованием флуоресцентно-меченых белков и некодирующих нуклеиновых кислот, связывающихся в различных участках РНК-полимеразы.
6.4. Тестирование разработанных методик поиска и анализа ингибиторов транскрипции на примере известных антибиотиков, подавляющих активность РНК-полимеразы.
6.5. Обобщение результатов предыдущих этапов работ.
6.6. Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Тема
Направленный поиск противовирусных соединений избирательного действия на основе модифицированных гетероциклических оснований нуклеиновых кислот и нуклеозидов.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
2
Тема
Поиск селективных ингибиторов поли(ADP-рибоза)-полимеразы I человека и определение их биологических и фармакологических свойств.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
2
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства – низкомолекулярного соединения на основе ингибитора BRAF энзима для терапии метастатической меланомы.
Продолжительность работ
2016 - 2018, 21 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства – низкомолекулярного соединения на основе ингибитора p110δ - дельта изоформы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) для лечения фолликулярной лимфомы.
Продолжительность работ
2016 - 2018, 21 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
0
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства – низкомолекулярного соединения на основе ингибитора p110δ - дельта изоформы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) для лечения фолликулярной лимфомы.
Продолжительность работ
2016 - 2018, 21 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2