Регистрация / Вход
Прислать материал

Исследование роли митохондрий в механизме гепатототоксического действия алкоголя: Предупреждение и снижение алкогольной интоксикации печени путем регуляции проницаемости внешней мембраны митохондрий

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.5009
Организация
ИТЭБ РАН
Руководитель работ
Холмухамедов Эхсон Лукманович

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 01.10.2009
Внедрен оптимальный и экономичный энзиматический метод получения и культивирования клеток печени (гепатоцитов) крысы, пригодных для биохимических исследований и флуоресцентной конфокальной микроскопии. Разработаны и созданы проникающие флуоресцентные зонды, состоящие из ковалентно сшитых 11 аминокислот TAT белка, известного как «проводящий» домен, 25 первых аминокислот белка SMAC/DIABLO, обеспечивающего доставку ТМРМ, флуоресцентной краски с устойчивой красной флуоресценцией и высоким квантовым выходом, в межмембранное пространство митохондрий. Разработан метод количественного определения проницаемости внешней митохондриальной мембраны в культурах гепатоцитов с использованием флуоресцентной конфокальной микроскопии, по распределению флуоресцентного декстрана размером 3 кДа в гепатоцитах. Эти молекулы свободно диффундирует через открытые пориновые каналы, в то время как закрывание каналов препятствует их накоплению. Создано руководство по использованию разработанных подходов и методов, которое включено в образовательную программу обучения студентов новым подходам исследования проницаемости внешней мембраны митохондрий в практических занятиях и лабораторных практикумах студентов и аспирантов, обучающихся на базе НОЦ ИТЭБ РАН, Пущинского Государственного Университета. Все работы этапа проводились под руководством и в тесном взаимодействии с руководителем проекта, российским ученым, работающим за рубежом. Все характеристики выполненных на данном этапе работ соответствуют требованиям задания.
Развернуть
2
02.10.2009 - 10.12.2009
Написан аналитический обзор, демонстрирующий, что гепатотоксичность этанола в первую очередь обусловлена потерей митохондриальных функций из-за нарушения обмена ключевыми митохондриальными субстратами между цитоплазмой и митохондриями. Подобраны оптимальные условия для количественного определения проницаемости внешней мембраны митохондрий к метаболитам с помощью измерения АДФ и ДНФ стимулированного дыхания, активности митохондриальной аденилат киназы в стрептолизин- или дигитон- пермеабилизованной модели гепатоцитов. Установлено, что окисление этанола в гепатоцитах подавляет скорости разобщенного дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий, снижает кальциевую емкость и увеличивает производство супероксид радикалов, подавляет активность фермента митохондриальной аденилаткиназы, синтез мочевины в гепатоцитах, митохондриальный путь синтеза серина из глицина, не влияя на цитоплазматический путь. Увеличение проницаемости внешней мембраны митохондрий высокими дозами дигитонина, образующего во внешней мембране митохондрий дополнительные поры, независимые от пориновых каналов, восстанавливает скорости протекания всех этих реакций. Обнаружено, что инкубация клеток с этанолом снижает накопление молекул флуоресцирующего декстрана в областях, занятых митохондриями, указывая на то, что обработка гепатоцитов этанолом приводит к закрыванию пориновых каналов во внешней мембране митохондрий. Впервые показано, что подавление синтеза мочевины и дыхания гепатоцитов этанолом частично обращается специфическими ингибиторами метаболизма этанола в гепатоцитах: алкоголь дегидрогеназы, ацетальдегид дегидрогеназы и цитохрома Р450Е1, а подавление активности фосфоинозитид-3-фосфокиназы, как и предотвращение активации А1-аденозиновых рецепторов оказывает действие подобное действию этанола. Установлено, что известные ингибиторы пориновых каналов, аналогично действию этанола, эффективно снижают скорость окисления водорастворимых субстратов, увеличивают уровень супероксид радикалов в митохондриях и ускоряют открывание МРТ, а дигитонин, образуя дополнительные поры во внешней мембране митохондрий, позволяет обходить закрытые ингибитором пориновые каналы. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс. Все работы этапа проводились под руководством и в тесном взаимодействии с руководителем проекта, российским ученым, работающим за рубежом. Все характеристики выполненных на данном этапе работ соответствуют требованиям задания.
Развернуть
3
10.01.2010 - 31.05.2010
Краткое описание выполненных работ:

Написан аналитический обзор демонстрирующий, что молекулы пориновых белков, образующие каналы во внешней мембране митохондрий, могут фосфорилироваться различными стресс киназами, такими как протеинкиназа А, протеинкиназа С, киназа-3 гликогенсинтетазы (GSK-3β), Akt, р38 киназа. В условиях алкогольной интоксикации основная роль в регуляции проницаемости внешней мембраны митохондрий отводиться GSK-3β и PI3K/Akt киназам. Идентификацированы алкоголь- индуцированные стресс киназы, вовлеченные в трансляцию сигналов от окисления этанола в цитоплазме к фосфорилированию белков пориновых каналов, и исследована их роль в регуляции проницаемости внешней мембраны митохондрий. Показано, что фосфорилирование митохондриальных белков поринов обеспечивается несколькими стресс- активируемыми киназами, такими как тирозиновая протеинкиназа и/или протеинфосфатаза и GSK-3β. Разработаны протоколы получения гелей и оценки степени фосфорилирования митохондриальных белков для исследования влияния алкоголя на фосфорилирование пориновых белков. Проведено сравнение эффективности методов, основанных на использовании неорганического ортофосфата (32Рi) и 32P-γ-меченной АТФ ([γ32Р]АТР). Установлено, что наиболее интенсивное фосфорилирование пориновых белков наблюдается при использовании (32Рi) с оптимальным временем фосфорилирования 3 мин. Впервые выявлено увеличение уровня фосфорилирования пориновых белков, а также митохондриальных белков с молекулярной массой 45-47 и 3,5 Да в условиях алкогольного стресса. Обнаружено, что степень фосфорилирования пориновых и других митохондриальных белков достигает максимального уровня после 4-х часового алкогольного стресса. Установлено, что для проведения комплексной оценки изменения проницаемости пориновых каналов внешней митохондриальной мембраны в условиях алкогольной интоксикации наиболее адекватным и подходящим является метод количественного определения активности GSK-3β киназы при помощи радиоактивных меток. Степень активации GSK-3β определяется по отношению общего содержания GSK-3β киназы и уровня фосфорилированной формы белка (фосфосерин-9 GSK-3β киназы). Показано, что этанол увеличивает активность GSK-3β киназы в цитозольной фракции клеток печени. Исследована роль GSK-3β киназы в регуляции фосфорилирования пориновых белков и степени проницаемости внешней мембраны митохондрий печени в условиях алкогольной интоксикации. Установлено, что при алкогольной интоксикации наблюдается снижение уровня фосфорилирования GSK-3β киназы в митохондриях печени. Обнаружено, что алкогольная интоксикация сопровождается снижением общего содержания GSK-3β киназы в 4-5 раза, что предполагает деградацию протеин киназы. Показано, что алкогольная интоксикация сопровождается увеличением митохондриального мембранного потенциала. Полученные данные, свидетельствуют о вовлеченности внутриклеточной 3β-киназы гликогенсинтетазы в фосфорилирование и закрывание пориновых каналов внешней мембраны митохондрий при острой алкогольной интоксикации.
Развернуть
4
01.06.2010 - 01.09.2010
Написан аналитический обзор, демонстрирующий изменения фенотипа клеток млекопитающих в зависимости от вида пориновых белков (VDAC1, VDAC2 или VDAC3), экспрессированных во внешней мембране митохондрий. Детально охарактеризована дозовая и временная зависимости действия этанола на основные метаболические системы клеток млекопитающих: гликолиз, синтез мочевины, экспрессию генов, активирующихся при различных стрессах, включая обработку этанолом. Показано, что 100 мМ этанола и 60 мин инкубации вызывает 50%-ое закрывание пориновых каналов. Разработан метод оценки закрывания пориновых каналов в интактных гепатоцитах по изменению синтеза мочевины, которая требует обязательного участия митохондрий. Показано, что окисление этанола приводит к подавлению скорости дыхания выделенных гепатоцитов, катализирующих синтез мочевины. Установлено, что каждый из трех независимых путей окисления этанола (алкоголь дегидрогеназный, цитохром р450 2Е1 и каталазный) вносит вклад в закрывании пориновых каналов. Впервые показано, что продукты окисления этанола и соединения, образующиеся в процессах перекисного окисления липидов (ацетальдегид, 4-гидроксиноненал, малоновый диальдегид), способны закрывать пориновые каналы, причем малоновый диальдегид подавляет активность пориновых каналов сильнее, чем ацетальдегид, а 4-гидроксиноненал обладает наименьшей эффективностью. Сделан вывод о том, что окисление этанола в гепатоцитах является необходимым условием изменения проницаемости пориновых каналов в условиях алкогольной интоксикации. Установлено, что фосфорилирование белков поринов является существенной частью механизма регуляции проводимости пориновых каналов и проницаемости внешней мембраны митохондрий. С использованием одномерного гель электрофореза и двухмерной тонкослойной хроматографии показано, что при оптимальной дозе алкоголя 100 мМ, 60 мин, при которой наблюдается 50% ингибирования пориновых каналов, происходит пропорциональное изменение уровня фосфорилирования белка порин-1, наиболее распространенной изоформы белков поринов, которые участвуют в образовании каналов во внешней мембране митохондрий. Показано, что все три изоформы пориновых белков (VDAC1, VDAC2 и VDAC3) определяют чувствительность клеток млекопитающих к действию ксенобиотиков путем регулирования проницаемости внешней мембраны митохондрий. Нокаутирование любой из изоформ VDAC существенно повышает чувствительность клеток млекопитающих к действию ксенобиотиков, таких как алкоголь и адафостин, путем уменьшения проницаемости внешней мембраны митохондрий, в нокаутированных животных действие этанола значительно уменьшается. С помощью специфических антител, а также FLAG-меченных сДНК для сверх экспрессии специфических изоформ пориновых белков, определена внутриклеточная экспрессия и митохондриальная локализация изоформ белков поринов. Установлено, что среди всех трех изоформ, только две (VDAC1 и VDAC2), имеют в своей аминокислотной последовательности остаток тирозина (Тир 195), который может быть фосфорилирован. Фосфорилирование этого остатка, так же как и остатка серина (Сер 104), изменяет проницаемость пориновых каналов.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Современные методы исследования молекулярной биоэнергетики дыхательных процессов 1. Изучение регуляции дыхания митохондрий растений в условиях низких температур. 2. Влияние стевиозида и его производных на дыхание растений. 3. Исследование молекулярно-клеточных механизмов газообмена в лёгких млекопитающих на фоне поступления в организм углеродного наноструктурного материала. 4. Изучение функционального состояния митохондрий в условиях гипоксии в культуре клеток HeLa. 5. Использование дыхательных ферментов и генетических маркеров в диагностике патогенезе послеродового эндометрита у женщин. 6. Исследование дифференциальной регуляции экспрессии генов, кодирующих ключевые белки внутренней мембраны митохондрий. 7. Изучение распространения и экспрессии белков несопряжённого и разобщённого дыхания у S. lycopersicum 8. Изучение активности и свойств изоформ аконитатгидратазы в печени крыс при пищевой депривации. 9. Роль света в регуляции экспрессии генов дыхательных ферментов растительных митохондрий. 10. Исследован
Продолжительность работ
2011, 5 мес.
Бюджетные средства
2 млн
Организация
ФГБОУ ВО "ВГУ"
профинансировано
Продолжительность работ
2009 - 2010, 15 мес.
Бюджетные средства
3,8 млн
Организация
НИИМББ
профинансировано
Продолжительность работ
2011 - 2013, 30 мес.
Бюджетные средства
2,91 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2012, 4 мес.
Бюджетные средства
2,3 млн
Организация
ИППИ РАН
профинансировано
Тема
Доклинические исследования радиофармацевтического препарата, действующего на белок RAF1 опухолевых клеток, для лечения злокачественных новообразований печени и внутрипеченочных желчных протоков
Продолжительность работ
2017 - 2019, 23 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
0
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства, действующего на фермент β-глюкуронидазу, для предупреждения развития рецидива рака мочевого пузыря
Продолжительность работ
2017 - 2019, 22 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
0
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства, действующего на фермент β-глюкуронидазу, для предупреждения развития рецидива рака мочевого пузыря
Продолжительность работ
2017 - 2019, 22 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2
Тема
Трековые мембраны новых поколений для нанотехнологий
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
3 млн
Количество заявок
6
Тема
Доклинические исследования инновационного лекарственного средства на основе пептидного антагониста к рецептору орексинов для подавления алкогольной зависимости.
Продолжительность работ
2013 - 2015, 30 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2