Регистрация / Вход
Прислать материал

Выяснение фундаментальных молекулярных механизмов деления клеточных мембран и поиск методов лечения болезней, связанных с патологией деления.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.5011
Организация
ИФХЭ РАН
Руководитель работ
Фролов Вадим Александрович

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 12.12.2009
1) Было проведено исследование зависимости сорбции и полимеризации динамина на поверхности мембраны от ее заряда и кривизны. С помощью электрофизиологических методов и флуоресцентной микроскопии было показано, что сорбция и последующая полимеризация динамина на поверхности мембраны существенно зависят от обоих факторов. Динамин сорбируется на плоскую БЛМ только при большом (более 85%) содержании отрицательно заряженного липида фосфатидилсерина (ФС), причем сорбция его имеет обратимый характер. Для сорбции динамина на поверхности НТ достаточно 15-20% ФС, динамин при этом необратимо полимеризуется, формируя жесткую стабильную структуру по всей длине НТ, которая сжимает НТ. Кинетика сжатия НТ динамином существенно зависит как от модуля изгиба мембраны, так и от наличия специфически связывающихся с белком липидов (фосфатидилинозитолы PIP2). Чем жестче мембрана НТ, тем медленнее идет сжатие и тем больше радиус люмена, который динамин навязывает НТ. Была сделана оценка энергии, выделяемой одной молекулой белка в процессе его сорбции и полимеризации на поверхности мембранной НТ. Ее значение оказалось равным, примерно, 10 kT. Мембранные НТ, имеющие близкий к физиологическому фосфолипидный состав (30%холестерина, 15% фосфатидилсерина) и значение модуля изгиба мембраны (около 40 kT), сжимаются динамином до радиуса люмена ~ 2 нм. Было показано, что гидролиз ГТФ препятствует формированию протяженной стабильной динаминовой спирали на поверхности НТ. Поэтому при одновременном добавлении динамина и ГТФ плавного уменьшения проводимости НТ не наблюдалось или оно было слабо выраженным.

2) Было проведено экспериментальное исследование деления НТ, индуцированного ГТФазной активностью динамина в случаях одновременной и последовательной аппликации динамина и ГТФ к НТ. Для НТ физиологического липидного состава одновременная добавка белка и нуклеотида через некоторое время приводила к делению НТ. Деление при этом шло через формирование структуры полуделения. Добавление ГТФ к НТ после ее сжатия динамином первоначально приводило к частичной разборке динамновой спирали и освобождению НТ, только после этого происходило деление. Данные наблюдение свидетельствуют о том, что деление НТ возможно только короткой динаминовой спиралью, в то время как длинная спираль, наоборот препятствует этому процессу. Было проведено исследование влияния добавок лизолипидов и холестерина к мембране НТ на процесс ее деления динамином. Показано, что присутствие лизолипида и холестерина в мембране существенно увеличивает модуль изгиба мембраны и, соответственно, начальный (равновесный) радиус НТ. Деление таких НТ динамином не происходило – в присутствии динамина и ГТФ наблюдалось лишь их незначительное поджатие. Это говорит о том, что определяющим фактором деления является радиус люмена, который динамин способен навязать НТ до гидролиза ГТФ.

3) Была изучена кинетика развития предделительного состояния НТ мембранной нанотрубки для двух случаев: когда деление индуцировалось ГТФазной активности динамина; и когда деление наступало в результате приложения к нанотрубке осмотического давления. С помощью электрофизиологических методов было показано, что при сжатии НТ до радиуса 2 нм с помощью осмотического стресса, происходило спонтанное деление НТ. Было показано, что такое деление шло без образования проводящих дефектов в стенке НТ, то есть через формирование структуры полуделения, когда внешний монослой остается интактным, а внутренний самозамыкается. Следовательно, критический радиус деления НТ составляет, примерно 2 нм. Примечательно, что радиус, который динамин навязывает НТ физиологического липидного состава, равен критическому радиусу деления, однако деления НТ при этом не происходит из-за того, что белковая спираль фиксирует внешний монослой, не позволяя внутреннему самозамыкаться. Была исследована кинетика формирования предделительного состояния НТ в присутствии динамина и ГТФ. Было выявлено, что деление НТ в этой системе является стохастическим процессом. Было показано, что время сжатия НТ динамином по всей длине в отсутствии ГТФ значительно превышает время ожидания деления НТ в присутствии ГТФ, кроме того, была показана прямая зависимость между длиной НТ и временем ожидания ее деления - чем длиннее НТ, тем быстрее она делится. При исследовании деления коротких НТ динамином были выявлены периодические флуктуации ее проводимости, а, следовательно, и формы, предшествующие делению. Времена этих флуктуаций соответствовали временам сборки и разборки динаминовой спирали на поверхности НТ, а амплитуда свидетельствовала о том, что максимальная длина спирали, которую динамин успевал формировать, составляла около 40 нм, что соответствует трем виткам спирали.
4. Руководителем работ в течении его пребывания на территории РФ было проведено 4 семинара, которые были посвящены целям исследования 1 ого этапа данного проекта. Были проведены следующие семинары:
• Определение геометрических и механических параметров мембранных нанотрубок
• Визуализация липидных нанотрубок (НТ) с помощью методов высокочувствительной флуоресцентной микроскопии
• Обсуждения механизмов создания мембранной кривизны специализированными белками (динамин и эпсин)
• Молекулярные механизмы деления мембран
Развернуть
2
01.01.2010 - 15.05.2010
Проведено исследование взаимодействия ENTH домена белка эпсина с липидными нанотрубками (НТ). Установлено, что ENTH домен сорбируется на поверхности мембраны, если в ее составе содержится 20% отрицательно заряженного липида. Показано, что сорбция ENTH домена приводит к изменению механических параметров НТ, следствием чего является отклонение радиуса НТ от равновесного значения. Эффект, оказываемый ENTH доменом на свойства липидной НТ, существенным образом зависит от наличия в ее мембране фосфотидилинозитола. В его присутствии сорбция ENTH домена приводила к почти двукратному увеличению как латерального натяжения, так и модуля изгиба мембраны. Были сделаны оценки значения спонтанной кривизны, которая появляется у мембраны вследствие сорбции на нее ENTH домена.
Было проведено теоретическое и экспериментальное исследование влияния, оказываемого перераспределением липидов с различной молекулярной геометрией между монослоями мембранной НТ, на ее механические параметры. Показано, что перераспределение становится существенным только при достижении больших значений кривизны (радиус НТ около 5 нм), а также, что перераспределение липидов приводит к уменьшению эффективного модуля изгиба мембраны.
Был произведен поиск возможных регуляторов деления мембран. Согласно данным, полученным в результате выполнения работ по проекту, ингибиторами процесса деления мембран являются все факторы, которые препятствуют локальному сжатию НТ динамином до критического радиуса (около 1 нм). Такими факторами являются лизолипиды, мутации блокирующие полимеризацию динамина или его частичное встраивание в мембрану. Катализаторами же процесса деления могут быть вещества и условия, которые наоборот способствуют динамину в сжатии НТ, такие как инозитолы или белки эпсины.
Руководителем работ в течении его пребывания на территории РФ было проведено 5 семинаров, которые были посвящены целям исследования 2 ого этапа данного проекта.
Развернуть
3
16.05.2010 - 15.08.2010
1) Разработка детального
описания молекулярного
механизма деления
мембранной нанотрубки
динамином.
2) Разработка программы
внедрения результатов
НИР в образовательный
процесс.
3) Проведение 3 научных
семинаров по анализу
результатов
исследования.
4) Составление итогового
отчета о НИР и
обобщение результатов
по всем направлениям
исследований.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Продолжительность работ
2012 - 2013, 14 мес.
Бюджетные средства
2,45 млн
Организация
ИЦиГ СО РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2005, 2 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Организация
ИФХЭ РАН
профинансировано
Тема
Разработка новых методов диагностики, профилактики и лечения широко распространенных, социально-значимых глазных заболеваний (катаракты и дегенеративных заболеваний сетчатки) на основе результатов фундаментальных исследований молекулярных механизмов зрительной рецепции в норме и патологии.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
2
Тема
Поиск молекулярных мишеней для разработки методов лечения псориаза и псориатического артрита.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
6
Тема
Разработка метода молекулярной диагностики болезни Альцгеймера.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
20 млн
Количество заявок
5
Тема
Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук по следующим областям: - общая биология и генетика; - физико-химическая молекулярная и клеточная биология; - фундаментальная медицина и физиология
Продолжительность работ
2010 - 2012, 26 мес.
Бюджетные средства
0 млн
Количество заявок
32
Тема
Проведение научных исследований молодыми кандидатами наук в следующих областях: - общая биология и генетика; - физико-химическая молекулярная и клеточная биология; - фундаментальная медицина и физиология
Продолжительность работ
2011 - 2013, 29 мес.
Бюджетные средства
0 млн
Количество заявок
67