Регистрация / Вход
Прислать материал

Структурная протеомика окислительно-восстановительных белков вовлеченных в регуляцию последствий окислительного стресса

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Рычков Георгий Николаевич

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 11.12.2009
Объектом исследования являются ферменты метионин-сульфоксид редуктаза Б (MsrB) и тиоредоксин (Trx) окислительно-восстановительной системы клеток млекопитающих.
Цель первого этапа заключалась в отработке методик наращивания, очистки и изотопного мечения белков MsrB и Trx, а также первоначальных исследований взаимодействия этих белков методами калориметрии и ЯМР-спектроскопии.
  Основными методами исследования являются ЯМР-спектроскопия и изотермальная титрующая калориметрия, требующие значительного количества высокоочищенных белков. В структурной ЯМР-спектроскопии белки должны быть изотопно обогащены ЯМР-активными ядрами 13C, 15N. Основным современным методом очистки рекомбинантных белков является афинная хроматография на никель-связанных смолах, при этом в рекомбинантные белки вводятся His-мишени.
  В процессе работы было осуществлено:
– проанализирована литература по теме исследования и выяснены современные представления о механизмах действия различных метионин-сульфоксид редуктаз. На основе проведённого анализа выработана стратегия исследования взаимодействий между MsrB и Trx c целью установления детального механизма окислительно-восстановительной реакции, катализируемой этими белками.
– отработан полный цикл биохимических манипуляций по экспрессии, выделению и очистке структурированных белков MsrB и Trx, пригодных для дальнейших калориметрических измерений. Анализ, клеточного экстракта белков, проведённый методом SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, созданных добавлением додецил-сульфата натрия), показал, что уровень экспрессии белков составил 25 мг/л , 40 мг/л, 40 мг/л и 20 мг/л для MsrB1, MsrB2, MsrB3 и Trx соответственно. Установлено, что количество примесей после стадии очистки белков не превышало 5%. Разработана методика получения очищенных белков MsrB и Trx, помеченных изотопами 13C и 15N, что является необходимым условием для их исследования гетероядерными ЯМР-методами.
– методом изотермальной титрирующей калориметрии было определено, что стехиометрия комплекса MsrB1 с Trx составляет 1. Термодинамические параметры, характеризующие взаимодействие между MsrB1 и Trx: энтальпия ΔH =-2,1 ± 0,4 ккал/моль и энтропия ΔS = + 18,5 кал/(моль K). Константа связывания Ka составила 3,1±0,5 10^6 M, что свидетельствует о достаточно прочном и специфическом взаимодействии в комплексе. На основе калориметрических данных выбраны оптимальные параметры для ЯМР экспериментов.
– получены одномерные, а также гетероядерные спектры 15N-HSQC белков MsrB1, MsrB2, MsrB3 помеченных изотопами 15N. Анализ полученных ЯМР-спектров свидетельствует о значительной конформацинной подвижности полученных образцов MsrB2 и MsrB3, что делает невозможным получение их пространственной структуры методом ЯМР спектроскопии. Поэтому для дальнейших исследований целесообразно использовать белок MsrB1 семейства белков MsrB млекопитающих, обладающий аналогичными MsrB2 и MsrB3 функциями.
  Степень внедрения: методики выделения и очистки белков MsrB и Trx, а также их изотопно-меченных форм, разработаны, прошли апробацию и имеют детальную документацию. Разработанные методики позволяют достигнуть высокого уровня экспрессии белков MsrB и Trx в клетках Escherichia coli и эффективно встраивать в состав этих макромолекул атомы изотопов 13C и 15N.
  Проведение работ на данном этапе подготовило базу для детального исследования структуры MsrB1, Trx и комплекса этих белков методами ЯМР-спектроскопии.
Развернуть
2
01.01.2010 - 30.04.2010
Проведён анализ двумерных (15N-HSQC, 13C-HSQC) и трёхмерных (NHCA, CBCANH, CBCA(CO)NH, HBHANH, HBHA(CO)NH) гетероядерных ЯМР спектров, в результате которого выполнено отнесение сигналов мутантных форм белков мыши MsrB1 U95C и Trx C35S.
Проведён анализ 15N-NOESY спектров, в результате которого были найдены ограничения на расстояния между набором атомов, включающим протоны основной цепи белка и протоны боковой цепи мутантных форм белков MsrB1 и Trx.
Ограничения на двугранные углы φ и ψ основной цепи белков были рассчитаны в программе TALOS на основании проведённого отнесения сигналов.
Пространственные структуры мутантных форм белков MsrB1 и Trx были определены в программе CYANA на основании рассчитанных ограничений на межпротонные расстояния и двугранные углы. Качество полученных структур белков было улучшено в программе GROMACS с учётом основных физических взаимодействий в присутствии явно заданного растворителя.
Полученное отнесение ЯМР-сигналов мутантной формы белка Trx С35S было размещено в базе данных BioMagResBank. Обновленная пространственная структура мутантной формы белка MsrB1 U95C размещена в базе данных PDB.
Развернуть
3
01.05.2010 - 30.08.2010
Проведены две процедуры титрования. В первой процедуре белок MsrB1, обогащённый ядрами N15 титровался необогащённым белком Trx, во второй — белок Trx, обогащённый ядрами N15 титровался необогащённым белком MsrB1. Обе процедуры проводились при двух значения pH, равных 5,5 и 6,5. Регистрация формирования комплекса осуществлялась с помощью 15N HSQC ЯМР-спектроскопии.
  Для обоих белков по изменению химических сдвигов 15N HSQC спектров определены аминокислоты, находящиеся в интерфейсе взаимодействия комплекса. В белке MsrB1 контактная область включает аминокислоты активного центра и его окрестностей; в белке Trx удалось выделить отдельные участки по полипептидной цепи, в совокупности формирующие итерфейс взаимодействия с MsrB1.
  На основании полученных экспериментальных данных методами белкового докинга, был найден ряд возможных конформаций комплекса, формируемого MsrB1 в окисленной форме и Trx в восстановленной форме. Отобранные на основе пространственных ограничений репрезентативные структуры уточнялись методом молекулярной динамики в водном боксе с явно заданным растворителем. По итогам молекулярного моделирования была определена возможная пространственная структура исследуемого белкового комплекса.
  Изучение структуры и динамических характеристик комплекса белков MsrB1 и Trx привело к заключению о том, что комплекс стабилизируется за счёт образования межбелкового бета-листа, пять нитей которого принадлежат белку MsrB1 и одна — белку Trx. Отмечены аминокислоты, вносящие определяющий вклад в основные физические взаимодействия, ответственные за формирование комплекса.
  Были выявлены каталитические аминокислоты, участвующие в реакции восстановления MsrB1 тиоредоксином. Стабилизация комплекса посредством образования межбелкового бета-листа приводит к возникновению напряжённости в структуре дисульфидной связи белка MsrB1, что, вероятно, понижает энергетический барьер её разрыва.
  Сравнение обнаруженного комплекса с известными комплексами Trx и Msr других семейств из ряда организмов выявило существенные различия в механизме образования комплексов, причиной которых является высокая мобильность N-конца MsrB1 мыши.
  Проведённые патентные исследования показали патентную чистоту результатов работы по проекту.
  По результатам НИР в редакцию журнала «Научно-технические ведомости СПбГПУ» направлено две статьи по темам: «Окисление белка метионин-сульфоксид редуктаза B1 мыши приводит к снижению его конформационной подвижности» и «In silico модель пространственной структуры комплекса белков MsrB1 и Trx окислительно-восстановительной системы мыши».
  На базе кафедры биофизики ГОУ «СПбГПУ» разработано методическое пособие «Отнесение сигналов в ЯМР-спектрах белков».
  На кафедре биофизики ГОУ «СПбГПУ» проведён семинар но теме «Механизмы катализа восстановления MsrB тиоредоксином».
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Продолжительность работ
2012 - 2013, 16 мес.
Бюджетные средства
5,25 млн
Организация
ИМБ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2009 - 2010, 15 мес.
Бюджетные средства
3,8 млн
Организация
НИИМББ
профинансировано
Продолжительность работ
2012 - 2013, 14 мес.
Бюджетные средства
2,39 млн
Организация
ФГБОУ ВО "ВГУ"
профинансировано
Тема
Регистрация маркеров окислительного стресса для оценки тяжести сердечно-сосудистых заболеваний, прогноза их течения и характеристики эффективности терапии
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
3 млн
Количество заявок
4
Тема
Разработки энергоэффективного метода преобразования газообразных углеводородных топлив в олефиновые мономеры окислительной конверсией.
Продолжительность работ
2014 - 2016, 28 мес.
Бюджетные средства
180 млн
Количество заявок
4
Тема
Научно-методическое и организационно-техническое сопровождение проведения 6-й Международной конференции «Биоинформатика регуляции и структуры генома» и Международной школы молодых ученых «Эволюционная биология и высокопроизводительные вычисления в биоинформатике».
Продолжительность работ
2008, 5 мес.
Бюджетные средства
0,5 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка постгеномных методов для молекулярно-генетической диагностики соматических заболеваний.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
96 млн
Количество заявок
17
Тема
Разработка опытно-промышленных технологий получения нового поколения медицинских имплантатов на основе титановых сплавов.
Продолжительность работ
2007 - 2009, 26 мес.
Бюджетные средства
225 млн
Количество заявок
2