Регистрация / Вход
Прислать материал

Масс-спектрометрическая идентификация регуляторных клеточных белков фосфатазы PP1, участвующих в репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Продолжительность работ
2009 - 2010, 13 мес.
Бюджетные средства
3,6 млн
Внебюджетные средства
0 млн

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Орлов Юрий Николаевич

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 12.12.2009
(а) Отработана методика контроля ВИЧ-репликации в клетках 293Т.
Транскрипция ВИЧ проверялась in vitro в клетка 293Т, трансфецированных вектором, содержащим промотор ВИЧ и ген люциферазы в качестве репортера. Контролем служил вектор, содержащий промотор цитомегловируса и ген-репортер LacZ. Анализ клеточной транскрипции проводили методом количественного RT-PCR.
(б) Разработан метод приготовления клеточных экстрактов HeLa и 293Т.
Выращены клетки карциномы HeLa и эмбриональные эпителиальные клетки 293Т почек человека в препаративном масштабе, из части которых были приготовлены экстракты белков для дальнейшей работы. Клетки отмывали фосфатным буфером сo 125 mM NaCl с плашек и лизировали в буфере содержащим 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, ингибиторы протеаз, 30 минут. Нерастворимую фракцию хроматина осаждали центрифугированием при 10,000хg в течении 90 минут при 4°C. Супернатант собирали и определяли содержание белка используя метод Брэдфорда.
(в) Отработан метод аналитического выделения CDK9- и PP1-ассоциированных белков, и метод их анализа с помощью изофокусировки и SDS-электрофореза. Проанализирована схема крупномасштабного выделения и очистки ядерных белков
(г) Проведен пробный МС-анализ синтетических пептидов и белкового комплекса CDK9/циклин T1 в следующих вариантах: ИЦР масс-спектрометр (Varian, США) с ионизацией с помощью MALDI и электроспрея; спектрометр Reflectron-3 (Bruker) в режиме MALDI-TOF; спектрометр Shimadzu в режиме LC-IT- TOF с электроспрей ионизацией, включая режим диссоциации, индуцированный столкновением с инертным газом (CID); ИЦР масс-спектрометр (Varian, США) с ионизацией с помощью MALDI в режиме МС-МС. Получены масс-спектры (воспроизводимость от 78 до 85%) контрольных пептидов в диапазоне масс до 3000 Да и с разрешением не хуже 20000, которые будут использованы при идентификации белков, участвующих в ВИЧ-репликации.
(д) Приглашенным исследователем прочитана лекция для студентов кафедры биофизики ГОУ «СПбГПУ» и для студентов Санкт-Петербургской государственной педиатрической медицинской академии на тему: «Новые мишени для ингибирования вируса иммунодефицита человека».
(е) На первом этапе работ в проекте приняли участие 4 студента ГОУ «СПбГПУ», три аспиранта и два кандидата наук в возрасте до 30 лет, что отражено в списке исполнителей отчета по первому этапу. Планируется их участие в работах в течение всего срока реализации НИР. Показатели П.1.5.1, П.1.5.2, П.1.5.3 Технического задания по Государственному контракту – достигнуты.
(ж) В ходе двухмесячного пребывания приглашенного исследователя в Российской Федерации были организованы и проведен научный семинар на тему «Методы фракционирования киназ и фосфатаз путем хроматогррафического и аффинного разделения» для студентов и сотрудников кафедры биофизики ГОУ «СПбГПУ» и для сотрудников Отдела молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН.
Выводы по результатам НИР 1 этапа:
1. РНК полимераза 2 очищается совместно с каталитической и регуляторными субъединицами PP1, что позволяет в дальнейшей работе идентифицировать регуляторную субъединицу PP1, участвующую в ВИЧ репликации, методом масс спектрометрии.
2. Предварительный масс-спектрометрический анализ показал принципиальную возможность идентификации пептидов по их массе с помощью ИЦР масс-спектрометра Varian и определения последовательности исследуемых пептидов по их вторичному масс-спектру с помощью масс-спектрометра Shimadzu в режиме LC-IT- TOF с электроспрей ионизацией.
Развернуть
2
01.01.2010 - 30.04.2010
Накоплен клеточный лизат в препаративном масштабе, приготовлена аффинная колонка с пришитыми антителами к РНК-полимеразе и приобретена аффинная микроцистин (МЦ)-агароза.
Проведено разделение части клеточного лизата путем центрифугирования на в градиенте глицерина, с последующим определением фракций содержащих РНК полимеразу II и PP1. Фракции содержащие РНК полимеразу II заморожены в глубоком холоде для дальнейшего изпользования.
Проведена аффинная хроматография фракции, содержащей РНК полимеразу II на колонке с пришитыми антителами против РНК полимеразы II. Анализ показал наличие РНК полимеразы II в элюате.
Проведена последующая очистка белковой фракции с применением микроцистин-агарозы. Дот-блот анализ показал наличие РНК полимеразы II, но анализ на SDS-полиакриламидном геле белков, прокрашиваемых SYPRO Ruby не обнаружил.
Проведен пробный 2D-электрофорез с нефракционированным клеточным лизатом.
Проведено масштабное разделение белковых гидролизатов фракции глицеринового градиента номер 20 с помощью хроматографии на обращённофазной ВЭЖХ-системе. Определена фракция содержащая РНК-полимеразу. Трипсиновый гидролизат белков из этой фракции очищен для масс-спектрометрии и проведены масс-спектрометрические измерения на хромато-масс-спектрометре IT-TOF (Shimadzu) в режиме LC-MS-MS.
Трипсиновый гидролизат белковой фракции очищенный на обращённофазной ВЭЖХ-системе был проанализирован на хромато-масс-спектрометре IT-TOF (Shimadzu) в режиме LC-MS-MS.
Развернуть
3
01.05.2010 - 30.08.2010
Из средств федерального бюджета:
3.1. МС-анализ белковых гидролизатов.
Накопление данных по пептидам и пептидным последовательностям и компьютерный анализ полученных пептидных последовательностей.
3.2. Подтверждение функциональности
идентифицированных белков с помощью РНК-интерференции (siRNA), а
именно, анализ фосфорилирования киназы CDK9 в условиях нокаута регуляторных субъединиц РР1. Иингибирование ВИЧ репликации будет контролироваться с помощью рекомбинантного вируса (с люциферазным геном в качестве репортера).
3.3. Построение физической модель
транскрипции вируса иммунодефицита
человека.
3.4. Разработка программы внедрения
результатов НИР в образовательный
процесс.
3.5. Обобщение полученных экспери-
ментальных данных, их анализ в кон-
тексте данных литературы и обоснова-
ние развиваемого направления исследо-
ваний.
3.6. Проведение патентных исследова-
ний.
3.7 Проведение научного семинара "Механизм репликации вируса иммунодефицита человека"
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Продолжительность работ
2010 - 2011, 20 мес.
Бюджетные средства
2,4 млн
Организация
ИМБ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2014 - 2018, 48 мес.
Бюджетные средства
43,5 млн
Организация
ИМБ РАН
профинансировано
Тема
Создание новых типов потенциальных лекарственных препаратов на основе специфичных ДНК-связывающих соединений для лечения инфекций, вызываемых вирусами герпеса и ВИЧ.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
1
Тема
Доклинические исследования противовирусного препарата пептидной природы, подавляющего репликацию вирусов гриппа человека А (H1N1)
Продолжительность работ
2016 - 2018, 26 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
0
Тема
Доклинические исследования противовирусного препарата пептидной природы, подавляющего репликацию вирусов гриппа человека А (H1N1)
Продолжительность работ
2016 - 2018, 24 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2
Тема
Масс-спектрометрическая идентификация комплексов антиген-антитело на подложке атомно-силового микроскопа.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
3
Тема
Создание базы данных масс-спектрометрических профилей для интраоперационной идентификации опухолей
Продолжительность работ
2014 - 2016, 29 мес.
Бюджетные средства
40 млн
Количество заявок
0