Регистрация / Вход
Прислать материал

Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов "quorum sensing" систем.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.5034
Руководитель работ
Баранова Анна Вячеславовна
Продолжительность работ
2009 - 2010, 13 мес.
Бюджетные средства
3,6 млн
Внебюджетные средства
0 млн

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Манухов Илья Владимирович

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 15.12.2009
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РАБОТ,
ВЫПОЛНЕННЫХ НА ЭТАПЕ № 1
«Конструирование бактериальных lux-биосенсоров для определения внутриклеточных факторов регуляции экспрессии генов "quorum sensing"»
государственного контракта с Федеральным агентством по науке
и инновациям от «20» июля 2009 г № 02.740.11.5034.
Шифр: «2009-1.5-504-005-019»
Период выполнения этапа июль 2009 года - 15 декабря 2009 года
Исполнитель: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика). 117545 г. Москва, 1-й Дорожный пр., д.1
Цель работы Исследование механизмов регуляции систем “quorum sensing” на пост-трансляционном уровне и взаимодействия белков – модуляторов с белками – мишенями (активаторами транскрипции оперонов).
Обеспечение развития устойчивого и эффективного взаимодействия с российскими учеными, работающими за рубежом, закрепление их в российской науке и образовании, использование их опыта, навыков и знаний для развития отечественной системы науки, образования и высоких технологий.

1. Наименование разрабатываемой продукции
  Lux-биосенсоры для анализа активности белка-регулятора LuxR, а также для детекции в среде низкомолекулярных регуляторов (автоиндукторов) систем “Quorum Sensing”.
1 Гибридная плазмида, с четырьмя терминаторами транскрипции и luxCDABE кассетой из Photorhabdus luminescens с регуляторной областью lux-оперона Aliivibrio fischeri.
2 Гибридная плазмида, с четырьмя терминаторами транскрипции и luxCDABE кассетой из P. luminescens с регуляторной областью и luxR геном lux-оперона A. fischeri.
3 Гибридная плазмида, с четырьмя терминаторами транскрипции и luxCDABE кассетой из P. luminescens с регуляторной областью и luxRI генами lux-оперона A. fischeri.
4 Гибридная плазмида, с четырьмя терминаторами транскрипции и luxCDABE кассетой из P. luminescens с регуляторной областью lsr оперона E. coli для определения аутоиндуктора II в среде.
2. Характеристика выполненных на этапе работ по созданию продукции
В ходе выполнения 1 этапа работ получен ряд генетических конструкций, необходимых для дальнейшего выполнения программы исследований согласно техническому заданию. В частности сконструированы гибридные плазмиды на основе векторов pUC18 и pGEX-KG, содержащие ген luxR и его делетированные варианты. Получены делеции N-концевого домена LuxR, ответственного за связывание регулятора с аутоиндуктором (N-3-оксогексаноил-лактон L-гомосерина) и С-концевого домена, ответственного за связывание с промотором. В составе pUC18 различные варианты luxR и его делеций необходимы для экспериментов по изучению влияния внутриклеточных факторов регуляции экспрессии генов "quorum sensing" in vivo. Конструкции на основе pGEX-KG содержат различные варианты гена luxR трансляционно слитые с глутатион трансферазой, что позволяют выделять искомые белки с помощью аффинной хроматографии на глутатион сефарозе. Показано, что С-концевой домен LuxR белка, активирует lux-оперон A. fischeri как минимум в 35 раз хуже, чем полноразмерный белок LuxR, и не зависит от аутоиндуктора.
Сконструированы гибридные плазмиды, содержащие luxCDABE кассету из P. luminescens под регуляторной областью (промотором) lux-оперона Aliivibrio fischeri, а так же с регуляторной областью и luxR геном и с регуляторной областью с luxR и luxI генами. Все три варианта гибридных плазмид предназначены для исследования особенностей регуляции генов "quorum sensing" систем, использующих в аутоиндуктор I типа.
Сконструированы гибридные плазмиды, содержащие luxCDABE кассету из P. luminescens под промотором гена E. coli lsrA и под промотором lsrA с геном регулятором lsrR. Данные конструкции находятся на стадии проверки в составе биосенсора на основе штамма E. coli MG1655. Предполагается, что полученный биосенсор позволит детектировать аутоиндуктор II ((2S,4S)-2,3,3,4-тетрагидрокситетрагидрофуран) в среде.
Ряд конструкций, полученных в ходе выполнения первого этапа, не описан в мировой литературе. В частности нет данных об исследованиях регуляторной области lux-оперона A. fischeri при помощи беспромоторных гибридных плазмид с четырьмя терминаторами транскрипции и термостабильной люциферазой из P. luminescens в качестве репортера. Для изучения регуляции промоторов, активирующихся с автоиндуктором II типа в E. coli ранее применялась только бета-галактозидаза (lacZ ген) в качестве репортерного белка, который является значительно менее чувствительным, чем люцифераза. Мастер регулятор «quorum sensing» систем белок LuxR является весьма нестабильным и термочувствительным, что приводит к большим сложностям при его выделении. В настоящей работе впервые предпринята попытка получить конструкции, в которых варианты luxR гена слиты с gst геном, что может улучшить растворимость белка LuxR и позволит выделить белок методом аффинной хроматографии.
В случае удачного выполнения работ второго этапа и получения результатов, свидетельствующих о возможности применения биосенсоров, полученных на основе данных гибридных плазмид, для поиска регуляторов «quorum sensing» систем, предполагается провести патентные исследования и подавать заявку на получение патента.
В ходе работ по данному проекту исполнители находились в тесном контакте с руководителем работ, д.б.н., проф. А. В. Барановой. Контакт осуществлялся как еженедельно по электронной почте и телефону, так и лично. В личном контакте на территории России, А.В. Баранова находилась в июле и в августе 2009 года, а также в настоящее время, с 10 декабря 2009 года. За это время, А.В. Баранова провела общеинститутский семинар на тему: «Биосинтез меланина как генетическая детерминанта метаболического синдрома» и лабораторный семинар «Роль автоиндуктора II типа в формировании биоплёнок и множественной лекарственной устойчивости бактерий» (дата общеинститутского семинара 24.07.2009; дата лабораторного семинара 23.07.2009). Также А.В. Баранова провела лабораторную обучающую сессию (5 часов) по редактированию научных текстов, предназначенных для публикации в зарубежных журналах с высокими импакт-факторами (22.07.2009). В августе – сентябре 2009 года А.В.Баранова совершила ряд усилий по успешному установлению сотрудничества лаборатории генетики бактерий ГосНИИгенетика с зарубежной лабораторией, Prof. Meighen (Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec H3G 1Y6, Canada). В июле 2009 года, А.В. Баранова провела переговоры с Dr. Aybike Birerdinc (Istanbul, Turkey), являющейся экспертом в области люминесцентной детекции нуклеиновых кислот, о возможности применения новой области для разрабатываемых биосенсоров. В настоящее время А.В. Баранова находится в России, для проведения очного лабораторного семинара и составления отчетов. Более того, А.В. Барановой забронированы билеты для визита в лабораторию в феврале 2010 г.

3. Области и масштабы использования полученных результатов.
Биосенсоры, основанные на гибридных плазмидах, с четырьмя терминаторами транскрипции и luxCDABE кассетой из P. luminescens, содержащих различные варианты регуляторной области lux-оперона A. fischeri (с генами luxR, luxR и luxI и без регуляторных генов), могут быть использованы для поиска аутоиндукторов I типа, блокаторов аутоиндукторов, а так же для изучения влияния внутриклеточных факторов регуляции экспрессии генов "quorum sensing".
Поиск блокаторов аутоиндукторов II типа (распространённых, например, в энтеробактериях) может позволить создание биосенсора на основе промотора гена E. coli lsrA с геном регулятором lsrR. Ранее для изучения регуляции промоторов, активирующихся с аутоиндуктором II типа, применялся штамм, полученный на основе Vibrio harveyi. В клетках E. coli использовался lsr промотор с бета-галактозидазой в качестве репортера. Предполагается, что сконструированная в рамках данной работы гибридная плазмида с бактериальной люциферазой в качестве репортерного белка, который является значительно более чувствительным, чем LacZ, позволит значительно повысить чувствительность биосенсора на ранних стадиях роста бактериальной культуры. Внутриклеточные факторы оказывают модулирующее действие на активацию “quorum sensing” сигналов именно на ранних стадиях роста культуры.
Регуляторный белок LuxR является весьма нестабильным и термочувствительным, что приводит к большим сложностям при его выделении и очистке. В настоящей работе получены конструкции, в которых luxR слит с gst геном, что может улучшить растворимость LuxR-GST химерного белка, и позволит выделить белок методом аффинной хроматографии. В случае если полученные результаты приведут к созданию метода выделения и очистки нативного белка LuxR предполагается начать работы по получению кристалла и рентген структурному анализу LuxR.
На основе исследований проводимых на первом этапе работ готовятся к защите две дипломные и одна курсовая студенческие работы. Часть результатов полученных в настоящей работе, планируется включить в диссертационную работу на соискание степени кандидата биологических наук.
Полученные результаты могут привести к появлению новых лекарственных антибактериальных препаратов, основанных на ингибировании “quorum sensing” регуляции генов, ослабляющих множественную лекарственную устойчивость микроорганизмов к антибиотикам. Достигнуты все намеченные индикаторы и показатели. Показатель количества исполнителей проекта результаты, работы которых в рамках НИР опубликованы в высокорейтинговых российских и зарубежных журналах, превысил запланированный и составил 4 человека. С использованием результатов, полученных в ходе выполнения этапа, подготовлено к печати три научные работы, две из них приняты в печать в рецензируемые журналы Микробиология и Биохимия:
1. С.А. Хрульнова, И.В. Манухов, А. П. Зарубина, Г. Б. Завильгельский. Aliivibrio logei, штамм KCh1 (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование lux-оперона. // Микробиология. 2009
2. В. Ю. Котова, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, «теплового шока» и окислительного стресса. // Биотехнология 2009, №6.
4. Выводы
1. Все работы по первому этапу выполнены полностью и в указанные календарным планом сроки. Получены все описанные в техническом задании генетические конструкции, и поставлены первые эксперименты, характеризующие свойства данных конструкций.
2. Иностранный руководитель провел два запланированных семинара и, дополнительно, лабораторную обучающую сессию по редактированию научных текстов.
Развернуть
2
01.01.2010 - 30.08.2010
1. Проведены исследования влияния и механизма действия шаперона GroEL/GroES (семейство Hsp60) н фолдинг белка LuxR и его делетированных форм.
2. Проведены исследования влияния и механизма действия протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм.
3. Определены кинетики активации lsr-оперона в присутствии аутоиндуктора II.
4. Получены данные о механизмах защитного действия бактериальных шаперонов семейства Hsp100 при термоинактивации белков в клетке. Показана связь термостабильности белков с их способностью к ренатурации с помощью клеточных шаперонов семейства Clp.
5. Проведён научный семинар по теме «Принципы создания конструкций доставки генетического материала в эукариотические клетки».
6. Проведены патентные исследований по теме: «Использование lux-биосенсора, сконструированного на основе идуцируемого промотора PlsrA, для определения аутоиндукторов второго типа в среде»
7. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Продолжительность работ
2010 - 2012, 25 мес.
Бюджетные средства
2,49 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2011 - 2012, 17 мес.
Бюджетные средства
8 млн
Организация
ИБХ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2010 - 2012, 30 мес.
Бюджетные средства
1,8 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2010 - 2011, 13 мес.
Бюджетные средства
0,5 млн
Организация
ИБГ РАН
профинансировано
Тема
Разработка методов направленной регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов c помощью белков-ингибиторов ростовых факторов.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 18 мес.
Бюджетные средства
8 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка новых способов регуляции экспрессии генов у эукариот.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
1
Тема
Контроль дифференцировки опухолей in vitro. Зависимость от условий культивирования и экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
1
Тема
Создание внутриклеточных белковых биосенсоров нового поколения.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
2
Тема
Внутриклеточная сигнализация в нормальных, опухолевых и стволовых клетках.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
1