Регистрация / Вход
Прислать материал

Внеклеточная мозговая матрица как определитель межклеточных коммуникаций и объект терапевтического вмешательства

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
28.11.2010 - 31.12.2010
1.1. Разработка структурного плана научных исследований на 2010-2012 гг.
1.2. Моделирование эпилептогенеза in vitro.
1.3. Pазработка концептуальной модели четырёхкомпонентного синапса.
1.4. Проведение симпозиума с обсуждением концепции запланированных исследований.
1.5. Литературный анализ современных данных по внеклеточному матриксу мозга.
Развернуть
2
01.01.2011 - 31.12.2011
1. Разработаны дизайн и изготовлены вектора для изучения роли белков ВКМ LGI1, CDC42 и RhoA вовлечѐнных в передачу сигнала от ВКМ рецепторов к актиновому цитоскелету. AAV: векторы, экспрессирующие человеческую форму матриксного LGI1 (обычную и с эпилептогенными мутациями), вектор для ингибирования эндогенной экспрессии LGI1 мышей на основе H1 кассеты, созданы конструкты, ингибирующие эндогенную CDC42 на основе кассеты H1, и экспрессирующие различные изоформы и мутанты CDC42 в гибридах с флюорофором EGFP.
2. Изготовлены плазмиды для одновременной визуализации пре- и постсинаптических терминалей, глии и внеклеточного матрикса мозга: базовые векторы, полученные из других лабораторий: FSy1.1GW (лентивирусный), AAV-Syn0.5- EGFP (Адено-ассоциированный или AAV); AAV-кострукты на основе флюорофора Tomato: сам Tomato и Synaptophysin-Tоmato (пресинаптическая метка); универсальные AAV конструкты для ингибирования экспрессии любых генов на основе кассеты H1 и дополнительных флюорофоров EGFP (зелѐный), Venus(желтый), mCherry (красный), TagBFP (фиолетовый); конструкты на основе AAV-Kid (или «малыш»). «Малыш» оптимизирован для экспрессии крупных, например, матриксных, белков-меток. На его основе сделаны гибридные метки на один из основных матриксных белков перинейрональных сетей бревикан. Конструкты включают экспрессию разных форм бревикана: BrevF и BrevS гибриды с фиолетовым флюорофором TagBFP; конструкты на основе лентивирусов, также экспрессирующих формы бревикана BrevF и BrevS гибриды с фиолетовым флюорофором TagBFP; векторы на основе AAV-Kid2 (немного модернизированный AAV-Kid), включающие экспрессию всех основных флюорофоров: EGFP (зелѐный), Venus (желтый), mCherry (красный), TagBFP (фиолетовый). Используются как базовые метки; конструкты на основе AAV-IRES-Kid2 - так называемые, «полицистронные» векторы-метки. Необходимы для экспрессии негибридные белков вместе с независимым флюорофором, также включают в себе экспрессию всех основных флюорофоров: EGFP (зелѐный), Venus(желтый), mCherry (красный), TagBFP (фиолетовый).
3. Изучена роль гиалуроновой кислоты, хондроитин и гепаран сульфатов в эпилептогенезе. Добавление гиалуронидазы 75 ЕД/мл на 17 день развития первичной культуры гиппокампа вызывало длительные изменения биоэлектрической активности нейронных сетей в отдаленном периоде с формированием суперпачки длительностью 25- 35 секунд, которую можно охарактеризовать как эпилептоподобная активность. Развитие спонтанной активности, а также выраженность реакции на введение гиалуронидазы зависела от аттрактивного субстрата (ламинина либо полиэтиленимина), применяемого при длительном культивировании. Механизм формирования эпилептоподобной активности при добавлении гиалуронидазы 75 ЕД/мл на 17 DIV отличался от механизма 4- АР вызванной активности. Активность, вызванная гиалуронидазой 75 ЕД/мл, не зависела от активности NMDA рецепторов, но зависила от АМРА рецепторов и частично от кальциевых потенциалзависимых каналов L- типа (L-VDCC). Полученные результаты вскрывают новый механизм развития эпилепсии при нарушении внеклеточного матрикса мозга.
4. Выявлены синаптические функции хондроитин и гепаран сульфатов. Показано, что аппликация обоих ферментов приводит к снижению среднего уровня спонтанной активности в диссоциированной культуре гиппокампа в период развития. Фактор роста фибробластов в комбинации с гепариназой вызывал значительное повышение спонтанной активности. Обратный эффект наблюдался при введении ингибитора FGF рецепторов в сочетании с гепариназой. Механизм влияния гепариназы I
  
на синаптическую передачу опосредован участием потенциалзависимых кальциевых каналов L типа.
5. Разработан протокол для исследования пластичности нейронных сетей с использованием электрической стимуляции. Разработаны методы длительной стимуляции клеток мозга на мультиэлектродной матрице, позволяющей неинвазивно изучать функциональные характеристики нейронов, классификации паттернов вызванной активности нейронов, математического анализа функциональных характеристик сетевых ответов.
6. Разработаны методы и микроскоп для трехмерной визуализации синаптического матрикса с использованием микроскопии со сверхразрешением.
7. Разработаны методы оценки активности RHO ГТФаз с помощью FRET– сенсора рRaichuRhoA, состоящего из FRET – пары (пара флуоресцентных белков, взаимодействующих между собой по принципу резонансной передачи энергии возбуждения).
8. Разработана математическая модель регуляции нейронной активности внеклеточным матриксом. Модель отражает ключевые экспериментальные факты влияния внеклеточного матрикса на нейронную сигнализацию. Анализ модели показал, что внеклеточный матрикс может действовать как эффективный регуляторный фактор в поддержании гомеостатического баланса нейрональной активности. Установлено также, что регуляторный каскад бистабильностью, что подтверждает гипотезу о том, что внеклеточный матрикс может играть роль в формировании и поддержании памяти.
9. Создана база данных по молекулам внеклеточного матрикса мозга, состоящая их списка генов из генома мыши, для которых имеются данные по их экспресии в нервных клетках (ECM_related_mouse_genes.xlsx).
10. Организован симпозиум по внеклеточному матриксу мозга.
Таким образом, в результате проведенного исследования полностью решены поставленные в 2011 году задачи, соответствующие цели проекта - изучение молекулярных механизмов влияния молекул внеклеточного матрикса на пластические свойства нейрон-глиальной сети мозга в норме и в условиях патологии, в том числе при эпилептогенезе.
Результаты, полученные при выполнении исследования, полностью соответствуют требованиям задания.
Отмечается высокий научный уровень проведенных исследований с использованием современных высокотехнологичных методов и подходов.
Предложенные экспериментальные методы позволяют повысить экономическую эффективность проведения экспериментальных исследований влияния матрикса на функционирование нейронных сетей при эпилепсии по сравнению с использованием в качестве тест-системы срезов мозга или целого мозга за счет длительного культивирования и возможности прижизненного структурного и функционального имиджинга культуры.
Предлагаемые решения и рекомендации по использованию результатов проекта являются обоснованными и сравнимыми с мировыми достижениями в области изучения сетевой нейрофизиологии и пластичности мозга.
Достоверность результатов подтверждается калибровкой используемых приборов и апробацией применяемых методов на известных объектах, совпадением значений, полученных различными методиками, совпадением результатов численного моделирования с аналитическими расчетами и экспериментально измеренными величинами, устойчивостью получаемых результатов при повторении условий эксперимента. Обоснованность полученных выводов следует из совпадения теоретических предсказаний полученным данным, внутренней непротиворечивостью всей совокупности результатов сходства результатов, полученных другими авторами с подобными объектами, логическим следствием общих выводов и частных положений.
Развернуть
3
01.01.2012 - 31.12.2012
1. Проведены эксперименты по изучению эпилептогенеза, вызванного разрушением ВКМ посредством двух ферментов – гиалуронидазы и гепариназы. Изучены закономерности спонтанной и вызванной кальциевой активности нейрон-глиальных сетей первичной культуры гиппокампа. Показано, что эпилептиформная активность, вызываемая разрушением ВКМ, напоминает активность, вызываемую блокадой L-типа кальциевых каналов и блокируется агонистом ГАМКергической передачи. Разработанные методы и полученные фармакологические данные представляют интерес для коммерческой реализации в плане разработки лекарственных препаратов, направленных на предупреждение либо восстановление внеклеточного матрикса (гиалуроновой кислоты и гепаран сульфатов) при эпилепсии и других нейродегенеративных и нейроциркуляторных заболеваниях, травмах, связанных с нарушением матрикса мозга.
2. Разработаны подходы и методы визуализации синаптической пластичности и ассоциированных изменений в матриксе. Создана серия вирусных векторов для визуализации сниаптической пластичности и для исследования роли молекулы внеклеточного матрикса LGI1 (leucine-richgliomainactivated 1) в эпилептогенезе. Разработанные методы и полученные фармакологические данные представляют интерес для коммерческой реализации в плане коммерческого использования данной серии вирусных векторов для визуализации сниаптической пластичности и, в частности, для исследования роли молекулы внеклеточного матрикса в различных научно-исследовательских лабораториях.
Выявлена тонкая структура внеклеточного матрикса, окружающего синапсы на дендритах нейронов. Применён метод STORM-микроскопии с супер-разрешением (Stochastic optical reconstruction microscopy) в сочетании с вторичными антителами, мечеными парами флуорофоров, такими как AlexaFluor405-AlexaFluor647 и Cy3-AlexaFluor647.
3. Проведено количественное моделирование синаптической динамики с применением математической модели четырёхкомпонентного синапса. Изучен эффект внесинаптической регуляции нейрональной сигнализации через активацию астроцитов на эффективность синаптической передачи (ранее в ходе выполнения работ по проекту была разработана модель влияния внеклеточного матрикса на нейронную сигнализацию). На основе существующих экспериментальных данных была предложена и исследована феноменологическая модель астроцитарной регуляции активности нейронной сети. Анализ модели показал, что астроцит способен эффективно регулировать частоту генерации электрических сигналов в зависимости от состояния активности нейронной сети. Интересным фактом является то, что активация астроцита, подобно полученному ранее влиянию ВКМ, может приводить к появлению бистабильности в динамике нейронной сети.
4. Изучена роль молекул внеклеточного матрикса в регуляции синаптической пластичности. Выявлено, что разрушение гепаран сульфатов приводит к уменьшению долговременной потенциации посредством механизма зависящего от L-типа кальциевых каналов. Показано влияние на регуляцию возбудимости и синаптическую передачу пирамидных нейронов поля СА1 хондроитин сульфат протеогликанов. Показано, что одним из механизмов снижения долговременной потенциации после обработки хондроитиназой АВС является снижение соотношения NMDA/AMPA токов в пирамидных нейронах СА1 при отсутствии изменения мембранной возбудимости. При этом также вызывается долговременная депрессия дисинаптических ингибиторных потенциалов.
5. Проведен анализ поведения, характерного для модели шизофрении, вызванной блокадой NMDA рецепторов антагонистом МК801. Иммуноцитохимически выявлены нарушения структуры внеклеточного матрикса в некоторых областях головного мозга, коррелирующие и измененным поведением мышей, оцениваемым по тестам «открытое поле», «условный рефлекс страха», «лабиринт Мориса», что свидетельствует об определенной роли внеклеточного матрикса мозга в патогенезе шизофрении.
Развернуть
4
01.01.2013 - 31.12.2013
1. Проведен анализ механизмов нарушения синаптической пластичности после обработки гепариназой.
2. Проведен анализ эпилептогенных механизмов гепариназной активности.
3. Разработан новый подход для анализа эффектов гиалуронидазы на пре- и постсинаптическую синаптическую пластичность.
4. Проведен анализ эпилептогенных механизмов гиалуронидазной активности.
5. Проведён анализ экстрасинаптической сигнализации после ферментативного разрушения компонентов ВКМ.
6. Выявлены новые механизмы синаптической пластичности после ферментативного разрушения компонентов ВКМ.
7. Проведён морфологический анализ взаимодействия между перисинаптическими астроцитарными отростками и нейрональными компонентами синапса.
8. Проведён анализ ритмической нервной активности после ферментативного разрушения компонентов ВКМ.
9. Разработана новая парадигма для анализа осцилляций - зависимой синаптической пластичности.
10. Опубликованы результаты тестирования воздействий, позволяющих подавлять эпилептиформную активность, возникающую после энзиматического разрушения гиалуроновой кислоты.
11. Усовершенствована математическая модель ингибиторных и возбуждающих нейрон – глия- внеклеточный матрикс взаимодействий во время сетевой активности.
12. Осуществлено моделирование эпилептогенеза in vitro.
Развернуть
5
01.01.2014 - 31.12.2014

Программа

Постановление №220 "О мерах по привлечению ведущих учёных в российские образовательные учреждения высшего профессионального образования"

Программное мероприятие

1 П220 – Государственная поддержка научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых
Продолжительность работ
2012 - 2013, 16 мес.
Бюджетные средства
4,39 млн
Организация
ИПФ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2009 - 2011, 25 мес.
Бюджетные средства
5,7 млн
Организация
ИППИ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2007 - 2009, 28 мес.
Бюджетные средства
164,78 млн
Организация
ИОФ РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2012 - 2013, 13 мес.
Бюджетные средства
1,18 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2009 - 2011, 24 мес.
Бюджетные средства
2,37 млн
Организация
ИНЦ РАН
профинансировано
Тема
Разработка технологий и аппаратных средств для оптико-реконструктивной хирургии глаза
Продолжительность работ
2007 - 2009, 28 мес.
Бюджетные средства
170 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка многофункционального манипулятора для роботоаcсистенции в высокоточной хирургии.
Продолжительность работ
2011 - 2013, 26 мес.
Бюджетные средства
198 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка технологии мониторинга системы мозгового кровообращения человека и выпуск опытных образцов автоматизированного диагностического комплекса для мониторинга и оценки нарушений мозгового кровообращения человека.
Продолжительность работ
2008 - 2010, 27 мес.
Бюджетные средства
115 млн
Количество заявок
1
Тема
Доклинические исследования гемостатического лекарственного средства на основе свертывающих компонентов донорской крови.
Продолжительность работ
2012 - 2014, 24 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
1
Тема
«Организационно-техническое обеспечение проведения молодежной конференции «Организационная коммуникация: Инновационные технологии организационных коммуникаций (теория, практика и дидактика)»»
Продолжительность работ
2011, 2 мес.
Бюджетные средства
0,9 млн
Количество заявок
2