Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка новых подходов к получению и использованию модифицированных фрагментов ДНК, их аналогов и миметиков для генной терапии.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.434.11.3001
Организация
ИМБ РАН
Продолжительность работ
2005 - 2006, 18 мес.
Бюджетные средства
6 млн
Внебюджетные средства
0 млн

Создание технологии и внедрение в медицинскую практику высокоэффективных методов генной терапии.

Соисполнители

Этапы проекта

1
01.04.2005 - 30.06.2005
2
01.07.2005 - 09.12.2005
Проведен синтез 32 пар олигонуклеотидов; клонирование синтезированных ДНК в первичных GFP-векторах. Получены три палиндромные конструкции для сайленсинга гена обратной транскриптазы вируса HIV-1 в экспрессирующем векторе pEGFP-N1 для экспрессии в клетках человека. Проведен их сиквенс для проверки правильности текстов ДНК. Для изучения влияния силы промотора на PHK-интерференцию получены одни и те же конструкции под промоторами U6 и CMV. Проведено клонирование доменов HIV-1 и гена CCR5 человека в векторе psiCHECK-2. Проведена селекция эффективных siРНК для атаки транскриптов HIV-1 и гена CCR5 человека c помощью ко-трансфекции первичных конструкций с репотрерными плазмидами psiCHECK-2. Эффективность siРНК оценивали по подавлению свечения люциферазы Renilla.
Проведены работы по поддержанию ряда лимфоидных линий культуральных клеток человека и наращиванию клонов кишечной палочки, а также по выделению препаратов ДНК в градиенте плотности хлористого цезия.
Развернуть
3
01.04.2006 - 30.06.2006
Созданы две кассетные генетические конструкции, кодирующие разные биологически активные зРНК. Химически синтезированы модифицированные ДНК и РНК, соответствующие текстам отобранных биологически активных з!РНК. Создана система для проверки т У!УО миметиков 51РНК, использующая репортерный ген люциферазы КешПа. Проведены работы по поддержанию ряда лимфоидных линий культуральных клеток человека и наращиванию клопов кишечной палочки, а также по выделению препаратов ДНК в градиенте плотности хлористого цезия.
Развернуть
4
01.07.2006 - 31.10.2006
В ходе выполнения данного проекта были синтезированы и клонированы последовательности ДНК, экспрессия которых может вызывать с помощью РНК-интерференции сайленсинг генов, вовлеченных в цикл развития HIV-1. Эти ДНК явились исходными для отбора последовательностей, пригодных для получения кассетных генетических конструкций, содержащих необходимые регуляторные последовательности для обеспечения экспрессии полученных ДНК в клетках.
  Для того, чтобы экспериментально проверить насколько эффективно идет транскрипция отобранных последовательностях ДНК с разных промоторов и как это влияет на результаты ген-специфического сайленсинга, шпилечные последовательности, предназначенные для экспрессии siРНК, которые нацелены на определенные мишени в транскриптах HIV-1, клонировали в трех векторах – в векторе pEGFP-N1, а также в векторах psiCHECK и pGeneClip. Последний вектор имеет промотор U1. Он связан с синтезом малых ядерных РНК человека и может узнаваться РНК-полимеразой II. Правильность данных конструкций проверена секвенированием. ДНК конструкций использовалась для получения липосом и трансфекции в культуральные клетки человека HEK 293 либо в клетки лимфоидного ряда, зараженные HIV-1.
  Проведено испытание конструкций в вирусной системе. Наряду с этим провели проверку работы конструкций и некоторых препаратов на невирусной системе. При этом влияние конструкций и препаратов оценивали по измерению экспрессии репортерного гена люциферазы Renilla. Для количественного анализа влияния синтезированных in vitro миметиков siРНК также использовалась эта система.
  В результате проведенного исследования (1) найдены уязвимые мишени в транскриптах вируса, которые атакуются наночастицами siРНК и подавляют продукцию HIV-1 на 90 и более %; (2) данные мишени также эффективно атакуют модифицированные препараты ДНК и РНК; (3) обнаружено, что миметики siРНК более эффективны, чем сама siРНК в ген-специфическом сайленсинге репортерного гена люциферазы. Эти данные необходимо использовать для разработки технологии, предназначенной для лечения ВИЧ-инфекции, а также других заболеваний с помощью РНК-интерференции. Данное направление исследований - так называемая РНК-нанотехнология - является самым перспективным для лечения болезней человека с помощью генно-инженерных подходов.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.2 Проблемно-ориентированные поисковые исследования фундаментального характера
Продолжительность работ
2005 - 2006, 18 мес.
Бюджетные средства
9,1 млн
профинансировано
Тема
Разработка новых подходов к получению и использованию модифицированных фрагментов ДНК, их аналогов и миметиков для генной терапии
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
6 млн
Количество заявок
6
Тема
Создание технологии производства высокоэффективных твердофазных сорбентов медицинского назначения
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
8
Тема
Организационно-техническое обеспечение проведения Всероссийской научной школы для молодежи «Инновационные подходы в медицинской реабилитации»
Продолжительность работ
2010, 8 мес.
Бюджетные средства
1,6 млн
Количество заявок
1
Тема
Создание антивирусных фармацевтических препаратов с высокими параметрами биодоступности на основе модифицированных липофильными каркасными фрагментами нуклеозидфосфонатов.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
3
Тема
Разработка технологий и выпуск опытных образцов приборных комплексов для синтеза, анализа и очистки фрагментов ДНК, РНК и их синтетических аналогов
Продолжительность работ
2008 - 2010, 29 мес.
Бюджетные средства
150 млн
Количество заявок
1