Выявление минимальной остаточной болезни при лейкозах посредством детекции одиночных молекул химерных РНК-онкомаркеров.

Разработана методика обнаружения молекул химерной мРНК AML1-ETO и определения их числа с помощью метода молекулярных колоний. Также разработан способ консервации образцов крови и костного мозга, исключающий деградацию РНК, и способы выделения нуклеиновых кислот из крови и костного мозга, позволяющие выделять как сумму ДНК и РНК, так и только РНК с выходом, близким к 100%. Таким образом, разработаны базовые процедуры, необходимые для обнаружения минимальной остаточной болезни в клинических образцах.
В то же время, процент выявления молекул РНК пока еще ниже, чем требуется техническим заданием. С целью увеличения чувствительности обнаружения молекул РНК, в дальнейшем, необходимо оптимизировать стадию обратной транскрипции.
Полученные результаты могут быть использованы в клинических лабораториях для консервации образцов крови и костного мозга, а также для выделения нуклеиновых кислот из таких образцов во всех случаях, где требуется выделение чистых недеградированных ДНК и РНК с высоким выходом, в том числе для диагностики рака и инфекционных заболеваний посредством анализа генетического материала с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР.

За отчетный период оптимизирована реакция обратной транскрипции, благодаря чему удалось поднять выход синтеза кДНК до 50%, что обеспечивает чувствительность диагностики 2 молекулы химерной мРНК AML1-ETO, как и определено техзаданием. В процессе работы установлен ранее неизвестный факт, что обратнотранскриптазная активность ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus специфически подавляется большими количествами РНК и ДНК. Установление этого факта позволяет дать общую рекомендацию не использовать Tth ДНК-полимеразу для определения РНК-мишеней с низким титром, так как это с высокой вероятностью может привести к ложноотрицательному результату диагностики.
Также, за отчетный период разработан метод обнаружения молекулярных колоний посредством гибридизации с флуоресцентными зондами на нейлоновых фильтрах, в том числе с использованием явления резонансного переноса энергии. Предложенные усовершенствования в методике гибридизации позволяют значительно упростить процедуру и многократно сократить время, необходимое для осуществления анализа. Использование для гибридизации двух разноокрашенных флуоресцентных зондов, а также гибридизация с парой зондов, способных к резонансному переносу энергии, позволяет различать молекулярные колонии, образованные химерными и нехимерными последовательностями, и тем самым существенно повысить специфичность диагностики.
Таким образом, задачи, определенные в техзадании для отчетного периода, выполнены полностью.
Полученные результаты могут быть широко использованы в клинических лабораториях, в том числе для диагностики рака и инфекционных заболеваний посредством анализа генетического материала с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР.
  Все примененные подходы и полученные результаты являются оригинальными и превосходят существующий мировой уровень.

За отчетный период создана полная диагностическая процедура, включающая в себя новый способ консервации биологических образцов, усовершенствованный метод выделения нуклеиновых кислот из клинических образцов. Разработанная диагностическая процедура позволяет обнаруживать одиночные молекулы мРНК AML1-ETO в крови и костном мозге человека. Разработаны контрольные тесты, способные проверить надежность и достоверность полученных результатов.
Разработанная диагностическая процедура испытана путем определения абсолютного титра мРНК AML1-ETO в клинических образцах, взятых у больных данным типом лейкоза на разных стадиях заболевания. Показано, что появление онкомаркера в крови и костном мозге пациентов, находящихся на стадии ремиссии, удается обнаружить за несколько месяцев до всплеска его титра, что может быть использовано для своевременного проведения повторного цикла химиотерапии. Разработанная процедура позволит повысить эффективность лечения лейкозов и, следовательно, понизить стоимость лечения онкологических больных и существенно снизить смертность. Базис данной технологии может быть использован для скрининга банков крови, выявления генетических аномалий эмбрионов путем анализа крови матери на ранней стадии беременности, экологического мониторинга, выявления следовых количеств генетически модифицированных продуктов в пище и криминалистической экспертизы.
Благодаря своим уникальным характеристикам данная технология сможет, в случае внедрения, успешно конкурировать (как на внутреннем, так и на мировом рынке) с существующими способами молекулярной диагностики с помощью иммунохимических методов и традиционной ОТ-ПЦР, в том числе ОТ-ПЦР в реальном времени. При массовом внедрении новой технологии цена одного теста может составить 300-600 руб., а число тестов в масштабах страны может составить десятки миллионов в год.