Создание химерных генетических конструкций для разработки метода рационального дизайна ферментов семейства цитохромов

Проведена селекция химических структур азольных соединений и создана копьютерная модель для прогнозирования взаимодействия азольных лигандов с CYP51MT. Измерены константы связывания азольных лигандов, отобранных в процессе создания модели. Показано, что азольные ингибиторы обладают высоким сродством к CYP51MT. Экспериментальная проверка компьютерных предсказаний показала высокий коэффициент корреляции между экспериментальными и теоретическими значениями. Эксперименты проводились c участием рекомбинантной формы CYP51. Очистка белка была существенно модифицирована по сравнению с методиками, используемыми за рубежом. Охарактеризованы спектральные свойства цитохрома Р450 в окисленном и восстановленном состояниях, стабильность фермента, его способность восстанавливаться в системах, генерирующих доноры электронов. Впервые предпринята попытка использовать для определения каталитической активности CYP51MT, вместо природного субстрата ланостерола, флюорогенные субстраты. Дальнейшее изучение механизмов взаимодействия азольных ингибиторов с CYP51MT целесообразно проводить в сравнении с его человеческим гомологом, с целью обеспечения необходимой селективности новых протвотуберкулезных препаратов и сведение к минимуму возможных побочных эффектов.

Молекулярное моделирование и внесение направленных модификаций в экспрессионную конструкцию CYP51MT. Выращивание рекомбинантной бактериальной культуры, гомогенизация образцов, проведение аналитического и препаративного хроматоргафического разделения. Оценка чистоты наработанных белков.

Краткое описание выполненных работ:
Масс-спектрометрический анализ препарата химерного белка масс-спектрометрическими методами (MALDI и ESI). Проведение каталитической реакции. Подготовка инкубационной смеси, анализ продуктов реакции. Построение калибровочных графиков. Обобщение материала.