Изучение процессов пероксидазного окисления замещенных бензинидов и нафтолов на поверхности нерастворимых носителей для создания высокочувствительных систем детекции в методах ДНК-диагностики

Проведен анализ научной литературы, описывающий существующие методы ДНК-диагностики. Проведен анализ научной литературы, описывающей свойства бета-лактамаз. Проведен поиск структур генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М типа в международных банках данных.
Проведено выравнивание аминокислотных последовательностей бета-лактамаз СТХ-М типа. На основании гомологии аминокислотных последовательностей ферменты данного типа разбиты на 4 основных подгруппы. Проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей генов внутри каждой группы. Определены позиции точечных мутаций нуклеотидов, приводящих к аминокислотным заменам в молекуле белка.
Изучено окисление замещенных бензидинов и нафолов, катализируемое иммобилизованной пероксидазой хрена, на поверхности пористых мембранных носителей и стекла. Установлено, что наиболее высокую чувствительность определения пероксидазы на поверхности найлона обеспечивает окисление орто-дианизидина. Показано, что чувствительность детекции может быть дополнительно увеличена при стабилизации промежуточного продукта окисления орто-дианизидина с использованием декстран сульфата. Установлено, чувствительность определения пероксидазы на стекле ниже в сравнении с детекцией на поверхности мембранных носителей.
Показано, что наиболее высокую чувствительность определения иммобилизованной пероксидазы на поверхности пористых мембран и стекла обеспечивает совместное окисление бензидинов и 4-Cl нафтола.

Установлено, что наиболее высокую чувствительность определения иммобилизованной пероксидазы в составе конъюгата со стрептавидином обеспечивает совместное окисление орто-дианизидина и 4-хлорнафтола; оптимизировано соотношение концентраций субстратов для увеличения выхода окрашенного продукта реакции; разработана методика проведения колориметрической детекции пероксидазы хрена в составе конъюгата со стрептавидином на поверхности стекла и пористых мембран.

Цель работы заключалась в разработке методов колориметрической детекции пероксидазы хрена на поверхности нерастворимых носителей для создания высокочувствительных систем детекции для ДНК-микрочипов.
Методы исследования: иммобилизация олигонуклеотидов на поверхности стекла, амплификация специфических генов с одновременным введением метки-биотина методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), гибридизация меченой ДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами на поверхности стекляной пластины, определение ферментативной активности иммобилизованного фермента по накоплению окрашенного продукта реакции.
Полученные результаты:
Показаны преимущества впервые разработанной системы колориметрической детекции пероксидазы хрена на поверхности стекла, заключающиеся в высокой чувствительности определения фермента, хорошей способности окрашенного продукта реакции адсорбироваться на поверхности стекла, быстрого времени накопления продукта.
Разработан метод гибридизационного анализа с колориметрической детекцией на примере определения точечных мутаций в генах β-лактамаз СТХ-М типа.
Проведено сравнительное изучение аналитических параметров методов ДНК-чипов с колориметрической и флуоресцентной детекцией. Установлено, что чувствительность выявления групп олигонуклеотидов методом ДНК-чипов с использованием колориметрической и флуоресцентной детекции достаточно сравнима. Показано, что специфичность определения большинства мутаций выше при использовании колориметрической системы детекции.

Ожидаемая экономическая эффективность при внедрении обусловлена существенно более низкой стоимостью реагентов и регистрирующего оборудования при использовании предлагаемой колориметрической детекции по сравнению с используемой в настоящее время флуоресцентной детекцией.
Область применения: клинические микробиологические лаборатории, научные исследования.
Прогноз развития метода обусловлен широким использованием пероксидазы хрена в качестве метки в различных методах аналитической биотехнологии. Разработанная система колориметрической детекции пероксидазы хрена может быть использована не только в методе ДНК-чипов, что показано в работе, но и в других диагностических методах, использующих пероксидазу хрена в качестве метки.