Ферменты для молекулярной биологии и генной инженерии.

Jптимизирован комплекс белков, включающих M-MLV ревертазу, ингибитор РНКаз из плаценты и термостабильную ДНК полимеразу со встроенным “горячим стартом” с целью разработки системы, обеспечивающей проведение реакций обратной транскрипции РНК и ПЦР в одной пробирке (ОТ-ПЦР). С использованием этой системы были разработаны диагностические тест-системы для тестирования РНК вирусов животных и растений. Показана возможность использования данной системы ОТ-ПЦР для оценки количества копий РНК в исследуемых препаратах с использованием методики проведения ПЦР в реальном времени с флуоресцентными олигонуклеотидными зондами.
Была проведена оптимизация комплекса белков, включающих урацил-ДНК-гликозилазу (УДГ) и термостабильную ДНК полимеразу со встроенным горячим стартом, с целью разработки антиконтаминационной системы проведения ПЦР.
Разработана технология препаративного производства ДНК-полимераз, полученных на первом этапе проекта; оптимизированы условия максимально эффективной работы ДНК-полимераз; разработана система, обеспечивающая проведение реакций обратной транскрипции РНК и ПЦР в одной пробирке; разработана деконтаминационная система, обеспечивающая эффективную работу урацил-ДНК-гликозилазы и ДНК-полимеразы при проведении ПЦР в одной пробирке.

В результате выполнения третьего этапа проекта получены специфические рекомбинантные scFv антитела к Taq-полимеразе, изучены ингибирующие свойства антител, создан препарат со встроенным горячим стартом, состоящий из рекомбинантного антитела и Taq-полимеразы. Получен препарат модифицированной Thermus thermophilus ДНК полимеразы/ревертазы, отработаны условия, обеспечивающие эффективное проведение реакций обратной транскрипции РНК и ПЦР в одной пробирке. Получена химерная M-MLV ревертаза с ДНК-РНКсвязывающим доменом и отработаны условия получения протяжённых копий к-ДНК. Созданы химерные 5’-3’-экзонуклеазы из Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus, Thermotoga neapolitanа с термостабильными неспецифическими дс-ДНК-связывающими доменами из Thermus aquaticus и Sulfolobus solfataricus, изучены возможности использования модифицированных 5’-3’-экзонуклеаз для оптимизации ПЦР в реальном времени. Разработаны схемы очистки препаратов модифицированных ферментов нуклеотидного обмена и проведена сравнительная характеристика полученных ферментов и их исходных аналогов.

Разработана технологии препаративного получения и производства опытных партий ревертаз и 5’-3’-экзонуклеаз, полученных в процессе выполнения проекта. Проведение лабораторных испытаний полученных ферментов с улучшенными свойствами и комплексных систем. Сопоставлены свойств новых ферментов и комплексных систем на их основе с параметрами ферментов и систем, использующихся в практике.