Создание универсальной технологии суперпродукции в растении целевых белков.

Сравнительная оценка методов и выбор модельной системы продукции ЦБ. Клонирование и анализ нуклеотидной последовательности генов, кодирующих вакциногены ESAT6 и Ag85 возбудителя туберкулеза человека Mycobacterium tuberculosis и вакциногены термолабильного энтеротоксина LT (субъединицы А и В) Е.coli. Определение оптимальных параметров системы экспрессии.

Созданы специфические вирусные векторы, одновременно экспрессирующие два и более белков. Получены рекомбинантные генетические конструкции, разработанные для экспрессии туберкулезных вакцинных белков и вакциногенов термолабильного энтеротаксина LT (субъединицы А и В) E.coli в растениях. Создан вектор на основе нового высокопатогенного штамма Х- вируса картофеля "Ока". Отработана и оптимизирована технология коагроинфильтрации для максимальной продукции вакциногенов.

Получены 3 патента на методы экспрессии целевого белка в растении. Опубликованы 6 статей в рецензируемых отечественных и международных журналах. Сделаны 4 доклада на отечественных и международных конференциях. Приняты к защите кандидатские диссертации (защита в октябре 2006 г.). На основе генома Х-вируса картофеля и вируса табачной мозаики сконструированы новые вирусные векторы для суперпродукции ЦБ в растениях. Изобретены новые патентабельные способы повышения продукции ЦБ в растении при подавлении умолкания генов. Приоритет авторов будет закреплен международным патентованием, который начнется в октябре 2006г.
Разработан метод доставки ЦБ в клеточные стенки. 24-аминокислотный трансмембранный домен лидерной части пектинметилэстеразы (ПМЭ), ответственный за секрецию ПМЭ на поверхность клеточной стенки, может быть использован для доставки ЦБ в апоплат и клеточные стенки растений. Выявлена роль ПМЭ в умолкании генов; подавление ПМЭ стимулирует образованме ЦБ. Синтезированы вакцинные гены M. tuberculosis, ESAT6, Ag85B и химерный трансляционно слитый ген ESAT6-Ag85B. Сконструированы штаммы E.coli, продуцирующие химерный вакцинный белок ESAT6-Ag85B. Накоплен и очищен химерный вакцинный белок ESAT6-Ag85B с целью последующей иммунизацией мышей.
  Получены специфические антитела к ESAT6-Ag85B. Созданы нереплицирующиеся и реплицирующиеся векторы для экспрессии в растении этих туберкулезных вакциногенов.

В ходе выполнения проекта получены следующие важнейшие результаты:
(1) Получены 3 патента на методы экспрессии целевого белка в растении и подана 1 заявка в патентное бюро Финляндии;
(2) Опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и международных журналах; 2 статьи в печати;
(3) Сделано 9 докладов на отечественных и международных конференциях;
(4) Приняты к защите 2 кандидатские диссертации (защита в ноябре 2006 г.).
На основе генома Х-вируса картофеля и вируса табачной мозаики сконструированы новые вирусные векторы для суперпродукции ЦБ в растениях. Изобретены новые патентабельные способы повышения продукции ЦБ в растении при подавлении умолкания генов. Приоритет авторов закреплен международным патентованием. Разработан метод доставки ЦБ в клеточные стенки. 24-аминокислотный трансмембранный домен лидерной части пектинметилэстеразы (ПМЭ), ответственный за секрецию ПМЭ на поверхность клеточной стенки, может быть использован для доставки ЦБ в апоплат и клеточные стенки растений. Выявлена роль ПМЭ в умолкании генов; подавление ПМЭ стимулирует образование ЦБ. Синтезированы вакцинные гены М.tuberculosis, ESAT6, Ag85B и химерный трансляционно слитый ген ESAT6-Ag85B. Сконструированы штаммы E.coli, продуцирующие химерный вакционный белок ESAT6-Ag85B.
  Получены специфические антитела к ЕSAT6-Ag85B. Созданы нереплицирующиеся и реплицирующиеся векторы для экспрессии в растении этих туберкулезных вакциногенов.
  Показана экспрессия ЕSAT6, Ag85B и слитого гена ESAT6-Ag85B в растениях Nicotiana benthamiana. Начата процедура международного патентования. Созданы условия, при которых уровень продукции достиг 1 г Ag85B на 1 кг листовой массы. Накоплен и очищен химерный вакцинный белок ESAT6-Ag85B и Ag85B. Начаты эксперименты на мышах по определению способности растительных вакцинных белков защищать млекопитающих от последующего заражения M.tuberculosis.
  Сконструирован рекомбинантный бинарный вектор pBI_Oka, содержащий полноразмерную копию генома вируса ХВК штамм "Ока" под контролем 35S промотора.
  Сконструированы синтетические гены, кодирующие гибридные белки, включающие LTB и внеклеточный домен М2 белка вируса гриппа, получены штаммы E.coli - продуценты этих гибридных белков. Сконструированы рекомбинантные вирусные векторы и показана экспрессия гибридного белка LTB-M2 в растениях Nicotiana benthamiana.
  Проведенная работа - это разработка дешевой системы продукции ЦБ, не имеющей аналогов в мире.