Разработка неинвазивной диагностики пола плода на основе циркулирующих нуклеиновых кислот материнской крови во время проведения стажировки в Институте химической биологии и фундаментальной медицины ННЦ СО РАН.

АННОТАЦИОННЫЙ ОТЧЕТ
о научно-исследовательской работе
«РАЗРАБОТКА НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПОЛА ПЛОДА НА ОСНОВЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МАТЕРИНСКОЙ КРОВИ»
РИ – 111.0/003/096
Государственный контракт от «26» октября 2005 г. № 02.444.11.7145.
в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям
развития науки и техники» на 2002-2006 годы»

Цель настоящей работы заключалась в повышении уровня научной подготовки стажера.
В качестве задач исследования определены следующие:
1. Изучить современное состояние научных исследований в изучаемой области.
2. Освоить теоретические и практические основы метода ПЦР в реальном времени.
3. Провести ПЦР-анализ последовательностей ДНК плода (SRY) в крови матери (свободно циркулирующих и связанных с клеточной поверхностью).
Основные результаты, полученные в ходе выполнения настоящего исследования следующие:
Внеклеточные нуклеиновые кислоты присутствуют в крови здоровых людей в малых количествах. По данным большинства авторов, концентрация внеклеточной ДНК в плазме не превышает 20-30 нг/мл. Поэтому для успешной детекции внеклеточных нуклеиновых кислот необходимы как особые методы выделения ДНК, обеспечивающие количественный выход нуклеиновой кислоты, так и чувствительные методы выявления последовательностей ДНК. На сегодняшний день, пожалуй, самым чувствительным и высокоспецифичным методом является ПЦР в реальном времени с различными типами флюоресцентных зондов, позволяющий определить даже 1 копию исследуемого локуса. Данный метод подходит и для выявления ДНК, плода, циркулирующей в крови матери в малых количествах (3-6% от общей фракции внеклеточной ДНК матери в I и III триместрах беременности, соответственно). ПЦР в реальном времени может быть использована, в том числе, и для количественной оценки фетальной ДНК в крови матери, так как известно, что концентрация внеклеточной ДНК плода повышается при патологиях беременности, таких как преэклампсия, преждевременные роды и др., а также в случаях вынашивания плодов с синдромом Дауна. Во время проведения стажировки был освоен метод ПЦР в реальном времени с TaqMan зондами, который в дальнейшем будет применяться для количественной оценки фетальной и материнской внеклеточной ДНК в плазме матери и в элюатах с поверхности клеток материнской крови при нормальной беременности и нарушениях развития плода различной степени тяжести.
Также были проведены эксперименты по выявлению пола плода посредством амплификации локуса SRY плода в материнской крови. Показано, что использование внеклеточной ДНК, связанной с поверхностью клеток матери, в качестве источника генетического материала плода повышает эффективность диагностики пола плода на 11%.
Также в процессе стажировки повышена теоретическая подготовка стажера, в частности, была получена информация о современном состоянии проблемы в мире, получена консультация о методических особенностях работы с внеклеточными нуклеиновыми кислотами, завершена работа над обзорной статьей. В целом благодаря стажировке степень готовности диссертационной работы «Исследование материнской и фетальной внеклеточной ДНК в норме и при нарушениях развития плода» достигла 70%.
Результаты проведенной работы соответствуют задачам, сформулированным в Техническом задании. Уровень полученных первых результатов соответствует современному состоянию исследований по изучению внеклеточной фетальной ДНК в материнской крови.
Полученные результаты могут послужить основой для разработки новых методов неинвазивной пренатальной диагностики различных состояний плода, в том числе его пола.



Руководитель работы
аспирант лаборатории цитогенетики _________________ А.Г. Токарева