Выполнение исследования свободных и связанных с поверхностью клеток крови циркулирующих нуклеиновых кислот методом флюоресцентной in siti гибридизации на метафазных хромосомах человека.

Основные результаты, полученные в ходе выполнения настоящего исследования следующие:
Развитие методов генной терапии, создание трансгенных организмов, исследования в области вирусной онкологии привели к накоплению данных о реальности существования процесса обмена нуклеиновыми кислотами между эукариотическими клетками и окружающей средой. Свободные нуклеиновые кислоты обнаруживаются в циркуляции (плазме крови) у здоровых людей; при некоторых заболеваниях (аутоиммунные заболевания, опухоли), содержание ДНК в сыворотке заметно возрастает. Показано, что эукариотические клетки секретируют в среду определенное количество ДНК и РНК, о биологических функциях которых пока можно только догадываться. Доказано существование природных механизмов транспорта нуклеиновых кислот в клетки, таких как рецептор-опосредованный эндоцитоз свободной ДНК, а также фагоцитоз апоптозных структур. Проникновение в клетки чужеродной ДНК и РНК может приводить к изменениям в генетических программах клетки. Известно, что встраивание в геном эукариотических клеток вирусной ДНК приводит к их онкотрансформации. Недавно показано, что не только вирусная ДНК, но и ДНК опухолевых клеток, поглощенная нормальными фибробластами посредством фагоцитоза, может приводить к их онкотрансформации in vitro и образованию опухолей in vivo. Были получены данные, свидетельствующие о возможности обмена полимерными интактными молекулами РНК между клетками и о возможной сигнальной роли РНК в межклеточных взаимодействиях у высших растений. Исследование явления секреции нуклеиновых кислот клетками необходимо для понимания их биологической роли в организме, участия в процессах взаимодействия между клетками, взаимной регуляции функционирования и дифференцировки клеток, для разработки методов ранней диагностики и мониторинга некоторых опасных заболеваний.
При помощи метода гибридизации ДНК на метафазных хромосомах человека были исследованы образцы циркулирующей и связанной с клеточной поверхностью ДНК, выделенные из крови здоровых доноров и больных пациентов. На первом этапе проводили полногеномную амплификацию образцов ДНК при помощи полимеразной цепной реакции в присутствие частично вырожденного праймера (DOP-PCR). В ходе ПЦР в реакционную смесь был добавлен аналог дезоксиуридинтрифосфата, содержащий в своей структуре биотин. На следующем этапе проводили гибридизацию полученных ДНК-зондов с метафазными хромосомами человека, препараты которых были получены из перефирических лимфоцитов. В результате проделанной работы было показано, что внеклеточная ДНК из крови здоровых доноров и больных раком молочной железы гибридизуется практически со всеми хромосомами, в основном в центромерной области. Результаты проведенной работы соответствуют задачам, сформулированным в Техническом задании.