"Рецепция и внутриклеточная сигнализация"

Цель проекта заключалась в исследовании роли урокиназы и Т-кадгерина в механизме ангиогенеза и разработке методологии их применения в клинике сердечно-сосудистых заболеваний на основе генно-клеточных технологий.
Исследование влияния урокиназы и Т-кадгерина на миграцию, адгезию и дифференцировку клеток сосудистой стенки и постнатальных клеток-предшественников проведено с применением современных комплексных методических подходов, используемых для анализа молекулярно-клеточных реакций in vitro и in vivo. Фенотип клеточных культур установлен с помощью морфологического анализа в сочетании с окрашиванием клеток флюорохром-мечеными антителами. Миграционную активность клеток оценивали с помощью микрокамеры Бойдена. Подавление экспрессии Т-кадгерина проводили с помощью трансфекции клеток малыми РНК для получения эффекта РНК-интерференции. Гиперэкспрессии Т-кадгерина достигали с помощью трансфекции клеток генетическими конструктами, несущими кДНК Т-кадгерина человека. Оценку экспрессии исследуемых белков проводили с помощью современных методов электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и иммуноблоттинга с применением ECL-метода визуализации. Уровень транскрипции оценивали с помощью качественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-PCR) и количественной RT-PCR в реальном времени.
В результате проведения НИР показано, что урокиназа стимулирует образование свободных радикалов кислорода в культивируемых ГМК посредством активации экспрессии NAD(P)H-оксидаз. Установлено, что гиперэкспрессия урокиназы в ишемизированной ткани стимулирует образование в ней кровеносных сосудов. Отработан метод локальной гиперэкспрессии Т-кадгерина в матригеле, который будет использован для изучения влияния Т-кадгерина на рост кровеносных сосудов. Выделены и охарактеризованы стромальные клетки из жировой ткани. Проведен подбор оптимальных условий выделения и культивирования этих клеток. Кроме того, отработан метод трансфекции стромальных клеток жировой ткани генетическими конструкциями и проанализирована длительность экспрессии трансгена этими клетками после введения в ткань.
Препарат на основе плазмидной ДНК, несущей кДНК урокиназы проходит токсикологическое и аллергологическое тестирования для представления рекомендаций по проведению клинических исследований возможности применения урокиназы для восстановления кровотока в ишемизированных тканях.