Создание регионально-адаптированных диагностических наборов для выявления гетерозиготного носительства мутаций в генах частых наследственных болезней.

В ходе выполнения работы на основе нового способа - анализа кривой плавления амплифицированных после лигирования фрагментов ДНК создано 4 диагностических набора для выявления гетерозиготного носительства мутаций в соответствующих генах:
1. Диагностический набор для популяционного скрининга на гетерозиготное носительство мутации c.807+5G>A в гене TCIRG1(11q12-q13), приводящей к развитию злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза, эндемичного в Чувашии;
2. Диагностический набор для популяционного скрининга на гетерозиготное носительство мутации С598Т в гене VHL, приводящей к развитию аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии.
3. Диагностический набор для популяционного скрининга на гетерозиготное носительство мутации с.806 С→Т (Pro269Leu) в гене DIA1, приводящей к развитию наследственной метгемоглобинемии 1 типа в Якутии.
4. Диагностический набор для популяционного скрининга на гетерозиготное носительство мутации del35G в гене GJB2, приводящей к развитию несиндромальной аутосомно-рецессивной нейросенсорной тугоухости.
Также в ходе выполнения работы и оценке эффективности предлагаемых диагностических наборов разработаны две мультиплексные тест-системы для одновременной диагностики мутации с.807+5G>A в гене TCIRG1, ответственной за развитие злокачественного аутосомно-рецессивного остеопетроза в Чувашии и мутации С598Т в гене VHL, ответственной за развитие аутосомно-рецессивного эритроцитоза в Чувашии
1) на основе метода Real-Time qPCR и 2) на основе анализа полиморфизма длин лигированных фрагментов ДНК (ПДЛФ-анализ). Данные тест-системы также пригодны для диагностики мутаций при проведении популяционного скрининга на гетерозиготное носительство.
Проведён сравнительный анализ информативности, пропускной способности, экономичности разработанных диагностических наборов и тест-систем с существующими аналогами, использующими анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).
Тест-системы на основе метода Real-Time qPCR обладают большой пропускной способностью, превышающей ПДРФ-анализ примерно в 4,5 – 5 раз, что позволяет их использовать для популяционного скрининга. Кроме того, следует отметить мультиплексные возможности таких систем (см. 2.1.2.2). Однако использование аллель-специфической Taq-man-пробы и ряда других реактивов характеризует данный способ как дорогостоящий.
Тест-системы на основе анализа кривой плавления амплифицированных после лигирования фрагментов ДНК удовлетворяют большинству требований, предъявляемых к методам диагностики, используемым для программ скрининга, а именно большая пропускная способность, простота и доступность, небольшие финансовые затраты, высокая информативность (100% для тест-систем для диагностики остеопетроза, эритроцитоза и метгемоглобинемии). Основными характеристиками этих тест-систем является то, что в них используется аллельспецифическая лигазная реакция, обладающая полной специфичностью, при последующей амлификации лигированных фрагментов используются универсальные праймеры, а для анализа результата на real-time используется не специфическая Taq-man-проба, а анализ кривой плавления, что существенно удешевляет реакцию.