Разработка комплексного метода тестирования эффективности работы систем репарации ДНК в клетках человека в норме и при патологии

Целью работы является создание научно-технического задела в разработке высокочувствительных методов тестирования эффективности работы систем репарации ДНК в клетках человека в норме и при патологии, которое обеспечит в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ. Анализ литературы и выбор стратегии исследования, осуществленный в хоте 1-го этапа проекта позволил сделать вывод, что для решения этой проблемы эффективно могут быть использованы химически модифицированные производные олигонуклеотидов. Этот подход активно развивается исполнителями проекта в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. Принцип подхода заключается в конструировании фрагментов ДНК, имитирующих интермедиаты репарации ДНК. Эти фрагменты содержат химически активную, либо флуоресцентную метку для последующей детекции продуктов взаимодействия ферментов и белков репарации с ДНК. Выбранные фрагменты ДНК могут быть применены в исследовании индивидуальных белков, систем, реконструированных из них, клеточных/ядерных экстрактов эукариотических клеток, а также в структурах, моделирующих хроматин, то есть в любых сколь угодно сложных системах, содержащих максимально полный ансамбль компонентов эукариотической репликации и репарации ДНК.
Среди белков, участвующих в репарации ДНК, есть несколько ключевых белков, количества которых, могут быть использованы в качестве прогностических маркеров для определения чувствительности клеток к агентам, повреждающим ДНК, в том числе, применяемым в терапевтических целях. К таким белкам относятся 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза (hOgg1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза (Ape1), Ku-антиген и поли(АДРрибозил)полимераза 1 (PARP1). Названные белки являются ключевыми для инициации репарации ДНК по различным механизмам, а именно репарации поврежденных оснований, репарации одно – и двухцепочечных разрывов. Поэтому комплексное слежение за активностью выбранных белков позволяет оценить одновременно эффективность различных путей репарации ДНК. Стратегия проекта впервые предполагает применить для определения статуса систем репарации ДНК человека комплексный подход, основанный на определении уровня активности 4-х ключевых белков репарации ДНК с помощью химически модифицированных ДНК-субстратов, несущих флуоресцирующие и химически активные группы. Сделан вывод о том, что для идентификации ключевых белков репарации и определения их активности перспективным является стратегия использования реакционноспособных ДНК-зондов, имитирующих поврежденную ДНК в сочетании с MALDI-TOF спектрометрией, а также флуоресцирующих аналогов субстратов систем репарации.

Созданы ДНК-зонды, имитирующие поврежденную ДНК и несущие реакцион-носпособные и флуоресцирующие метки.
  Установлено, что регистрация продуктов кросс-сшивок белок-ДНК методами гель-электрофореза и продуктов разрыва ДНК с помощью метода FRET позволяет детектировать белки в количестве до 10 фмоль, что существенно ниже возможного уровня этих белков в клетках челове-ка.

Методика протестирована на лизатах клеток человека. Сделан вывод о том, что выбранная стратегия пригодна для идентификации ключевых белков репа-рации и определения их активности в организме человека.