Рациональный дизайн промышленных ферментов, основанный на методах молекулярного моделирования

Проведен анализ научно-технической литературы, баз данных, существующих расчетных программ, алгоритмов и других материалов по методам моделирования структуры и субстратной специфичности мутантных форм ферментов.
Рассмотрены методы получения мутантных форм ферментов, проведен сравнительный анализ существующих методов инженерии белков и выбран наиболее простой, быстрый, эффективный и широко используемый в настоящее время метод получения мутантных генов – сайт-специфический мутагенез с использованием ПЦР.
На основе рассмотрения структуры ?-галактозидазы из T. maritima и ее ближайших структурных гомологов, выработана стратегия рационального дизайна комплексов ТмГал с заданными субстратами.
Выполнена работа по поиску и определению участков молекулы каталитической субъединицы энтеропептидазы человека, предположительно отвечающие за специфичность фермента. Выбраны участки молекулы каталитической субъединицы энтеропептидазы человека для дальнейшего молекулярного моделирования, определены методы получения мутантных вариантов энтеропептидазы, анализа их биологической активности и специфичности.
Сформулированы возможные направления решения задач, поставленных в ТЗ, и приведено обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач.
Подготовлен проект соглашения о выполнении работ по проекту «Рациональный дизайн промышленных ферментов, основанный на методах молекулярного моделирования» в рамках международного консорциума (проект IRENE ), в котором изложены внутренние директивы по управлению проектом.

Разработаны методология и программное обеспечение, позволяющие выявлять ключевые для специфичности остатки фермента, моделировать структуру, а также субстратную специфичность мутантных форм пенициллинацилаз, энтеропептидаз и альфа-D-галактозидаз. Разработаны методы экспериментального тестирования основных каталитических свойств мутантных ферментов и количественные критерии, позволяющие характеризовать наиболее важные свойства: каталитическую активность препаратов, содержание активных центров, профиль субстратной специфичности, стереоселективность действия, синтетическую способность в водной среде. Проведен сравнительный анализ строения активных центров пенициллинацилаз и альфа-D-галактозидаз, обладающих высокой гомологией аминокислотных последовательностей и сходством трёхмерных структур. Отработаны методы выделения и очистки мутантных ферментов, методы тестирования ферментативной активности и количественные критерии, характеризующие основные каталитические свойства.

Проведена апробация разработанной технологии рационального дизайна ферментов в масштабных вычислительных экспериментах по моделированию улучшенных промышленных биокатализаторов в органическом синтезе и для получения энантиомерно чистых веществ. Разработаны методы препаративного получения наиболее эффективных мутантных форм.

Проведено совершенствование технологии рационального дизайна ферментов. Разработаны технологии выделения и очистки мутантных ферментов, изучены каталитические свойства мутантных ферментов. Получены опытные партии мутантных ферментов. Проведены предварительные испытания, подтвердившие высокую каталитическую эффективность полученных биокатализаторов.

Получены опытные партии ферментов и проведено их изучение как катализаторов ферментативного органического синтеза, биотрансформации низкомолекулярных и высокомолекулярных субстратов, процессов получения энантиомерно чистых соединений.