«Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области биокаталитических, биосинтетических и биосенсорных технологий»

1. Наименование разрабатываемой продукции
Биокаталитические технологии синтеза органических кислот и энантиомерно-чистых соединений для полимерной химии, медицины и экологической биотехнологии на основе микроорганизмов-продуцентов, селекционированных из природных и антропогенно-измененных почв.
2. Характеристика выполненных на этапе работ по созданию продукции
2.1. Результаты работы на 1 этапе, в том числе: разработанные виды продукции.
Биокаталитический синтез целевых соединений планируется проводить посредством реакций гидролиза соответствующих субстратов – нитрилов, эфиров и амидов до карбоновых кислот. Для получения энантиомерно-чистых веществ (нестероидные противовоспалительные средства, ибупрофен, напраксен) и других планируемых продуктов необходима гидролитическая трансформация ароматических соединений – производных бензойной и арилпропионовых кислот. Поэтому отбор перспективных штаммов проводили по признакам:
– способности микроорганизмов к биотрансформации ароматических соединений, среди метаболитов которых есть производные бензойной и арилпропионовой кислот;
– способности к трансформации нитрилов, эфиров и амидов.
Проведен скрининг высокоактивных почвенных изолятов и их исследование на способность к биотрансформации алифатических и ароматических нитрилов, амидов и эфиров. Из органогенных, гумусовых и ризосферных зон природных и техногенных почв выделено более 1200 изолятов микроорганизмов, обладающих способностью к биотрансформации нитрилов, первичных амидов, сложных эфиров, а также ароматических соединений (производных бензола и пиридина, конденсированных, бициклических, гетероароматических и замещенных аренов). Проведена идентификация наиболее активных изолятов.
В результате проведенной селекционной работы составлена рабочая коллекция перспективных для биотехнологии микроорганизмов, активно трансформирующих алифатические и ароматические соединения – аналоги и предшественники целевых субстратов. Для дальнейшей работы отобрано 48 штаммов, обладающих нитрилгидратазной и нитрилазной активностями, трансформирующих алифатические нитрилы; 12 – обладающих амидазной активностью, трансформирующих алифатические амиды; 17 – трансформирующих алифатические эфиры; 12 – метаболизирующих производные бифенила; 32 культуры метаболизирующие производные бензойной кислоты; 24 – метаболизирующие конденсированные арены.
В результате скрининга первичных изолятов получено 12 штаммов, обладающих нитрилгидратазной, 6 – амидазной, 4 – нитрилазной и 6 – эстеразной активностями, превышающими в оптимальных условиях 5 мкмоль/мг/мин, а также 5 штаммов, трансформирующих бензонитрил и бензамид; 8 – трансформирующих 3-цианопиридин и никотинамид; 12 – метаболизирующих нитрил миндальной кислоты; 7 – метаболизирующих фенилглицинонитрил.
Также отобраны активные штаммы бактерий-деструкторов широкого спектра ароматических соединений, в том числе полициклических ароматических соединений, бифенила (хлорированных бифенилов), карбоновых кислот (бензойной, салициловой, гентизиновой, орто-фталевой и других), определено их таксономическое положение, проведены генетические и биохимические исследования деградативных систем.
Штаммы рабочей коллекции будут использованы для селекции более активных форм и анализа их ферментов на энантиоселективность.
Отработаны методы ПЦР-анализа нескольких групп генов биотрансформации. Проведена начальная часть молекулярно-генетического исследования ферментов метаболизма нитрилов и эфиров.
2.2. Новизна применяемых решений в сравнении с другими работами, родственными по тематике и целевому назначению и определяющими мировой уровень.
Впервые проведен скрининг широкого круга почвенной микрофлоры на наличие культур бактерий, активно трансформирующих ароматические и алифатические производные карбоновых кислот. Получена представительная рабочая коллекция новых штаммов, экспрессирующих ферменты-гидролазы, перспективные для биокаталитического применения. Проведенные скрининговые и селекционные исследования соответствуют существующей мировой практике проведения аналогичных поисковых работ.
2.3. Особенности исследования, разработки, метода или методологии проведения работы на отчетном этапе.
На отчетном этапе применялись современные способы скрининга и селекции, сочетающие традиционные методы отбора (прямой высев на селективные и богатые среды, методы серийных разведений и питательных пластин) и молекулярно-генетические исследования, включающие ПЦР-анализ, секвенирование ДНК и др. Идентификацию бактерий осуществляли методами полифазной таксономии, а также с помощью анализа генов 16S РНК. Для детекции генов ферментов, трансформирующих исследуемые вещества, применяли методы ПЦР-анализа со специфическими праймерами и секвенирование. Измерение активности катаболических ферментов и детекцию продуктов биотрансформации анализировали методами спектрофотометрии, газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии.
2.4. Объекты интеллектуальной собственности, созданные на отчетном этапе.
С целью интенсификации молекулярно-генетических исследований разработана программа YACWGUI 1.2, являющаяся графической оболочкой, расширяющей возможности консольного приложения ClustalW. Программа предназначена для множественного сравнения последовательностей ДНК и белков и установления их филогенетических связей.
3. Области и масштабы использования полученных результатов
3.1. Области применения полученных результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться полученные результаты или созданная на их основе инновационная продукция).
Результаты НИР могут быть использованы на базе новых или имеющихся мощностей по производству мономеров и полимерных материалов на их основе, на предприятиях химической промышленности г. Перми и Пермского края, других регионов Российской федерации. Биокатализаторы для синтеза энантиомеров позволят производить нестероидные противовоспалительные средства для фармацевтической промышленности, такие как напроксен и ибупрофен.
Разрабатываемые биокатализаторы также могут быть использованы очистки сточных вод и воздуха от загрязняющих органических кислот на предприятиях химической и нефтехимической промышленности.
Результаты НИР будут внедрены в образовательный процесс для подготовки квалифицированных специалистов в области промышленной биотехнологии, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и генетики, владеющих новейшими методами исследования и конструирования генетических систем, создания штаммов-продуцентов ферментов, применимых в химической и фармацевтической промышленности; создания биодеструкторов токсичных органических соединений для решения экологических проблем; обладающих знанием производственных процессов, используемых в промышленной и экологической биотехнологии.
Повышение уровня образования по тематике НИР должно обеспечить подготовку квалифицированных кадров по биотехнологическому профилю для учреждений и предприятий Пермского края и смежных регионов,
3.2. Ход практического внедрения полученных результатов.
  Результаты выполненных на 1 этапе исследований внедрены в образовательный процесс (использованы в курсе лекций «Промышленная микробиология», 4 курс, биологи, ПГУ).
3.3. Оценка или прогноз влияния полученных результатов, товаров и услуг, созданных на основе полученных результатов, на подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, достижение или превышение заданных индикаторов и показателей.
Селекционированные штаммы, составляющие рабочую коллекцию, перспективны для применения в биокаталитических процессах. На дальнейших этапах выполнения проекта рабочая коллекция будет использована для получения штаммов, наиболее активных в отношении целевых биокаталитических реакций и для создания биокатализаторов.
С целью подготовки высококвалифицированных специалистов в области промышленной биотехнологии, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и генетики и их закрепления в сфере науки, образования и современных технологий, сформирован научно-исследовательский коллектив, включающий 42 молодых сотрудников. К выполнению проекта привлечены 12 молодых специалистов, 3 аспиранта, 26 студентов кафедр ботаники и генетики растений, микробиологии и иммунологии, физиологии растений и микроорганизмов биологического факультета ПГУ и 1 студент механико-математического факультета ПГУ.
Запланированные работы и требования, заложенные в техническом задании, выполнены.
4. Выводы
4.1. Выделены культуры микроорганизмов, перспективные для биотехнологии синтеза алифатических и ароматических производных карбоновых кислот, в т.ч. мономеров для полимерной химии и нестероидных противовоспалительных средств.
4.2. Разработана методика выделения активных клонов микроорганизмов и скрининга по уровню гидролитической активности.
4.3. С целью интенсификации молекулярно-генетических исследований разработана компьютерная программа YACWGUI 1.2, предназначенная для анализа генетических последовательностей.
4.4. Полученные штаммы представляются перспективными для последующей разработки лабораторной технологии синтеза алифатических амидов и карбоновых кислот, а также получения штаммов для энантиоселективного синтеза нестероидных противовоспалительных средств.
4.5. Для выполнения проекта, с целью подготовки высококвалифицированных молодых специалистов и их закрепления в сфере науки, образования и современных технологий, сформирован научно-исследовательский коллектив, включающий 42 молодых сотрудников. К исследованиям по теме проекта привлечены 12 молодых специалистов, 3 аспиранта, 26 студентов биологического и 1 студент механико-математического факультетов ПГУ.
4.6. Результаты выполненных исследований внедрены в образовательный процесс (использованы в курсе лекций «Промышленная микробиология», ПГУ).

1. Наименование разрабатываемой продукции
Биокаталитические технологии синтеза органических кислот и энантиомерно-чистых соединений для полимерной химии, медицины и экологической биотехнологии на основе микроорганизмов-продуцентов, селекционированных из природных и антропогенно-измененных почв.
Этап 2: Разработка методов получения иммобилизованных ферментных систем для синтеза органических кислот.
2. Характеристика выполненных на этапе работ по созданию продукции
2.1. Результаты работы на 2 этапе, в том числе: разработанные виды продукции.
• Разработаны методы адсорбционной иммобилизации и включения в гели агарозы бактериальных клеток продуцентов ферментов, трансформирующих сложные субстраты, в том числе стереоселективные. Получены стабильные биокатализаторы для гетерогенного катализа, способные работать в течение 4 и более циклов биокаталитических реакций без значительного снижения активности.
• Исследованы методы иммобилизации нитрилгидролизующих ферментов на препаратах технологичного гранулированного пористого углеродного материала – сапропеля. Установлено, что адсорбция на сапропеле приводит к стабилизации их структуры, повышению термостабильности (сдвиг пика активности более чем на 10°С), стабильности при хранении и срока действия (способность работать в течение 5 и более циклов биокаталитических реакций).
• Полученные результаты позволят использовать биокатализатор повторно в ходе синтеза, использовать биокатализатор в проточном непрерывном или длительном многоцикловом периодическом режиме, а также дают возможность получать высокочистые продукты биокаталитического синтеза за счет простого и качественного отделения биокатализатора от жидкой фазы, содержащей продукты биотрансформации.
• Разработанные методики иммобилизации отличается эффективностью и простотой в исполнении, основаны на использовании материалов (на основе углеродных материалов, полисахаридов агара) коммерчески доступных для применении в промышленных масштабах.
• В результате скрининга лабораторной коллекции микроорганизмов, отобранной на 1-м этапе, селекционированы каталитически-активные штаммы способные активно трансформировать стерически затрудненные ароматические соединения, а также оптически активные субстраты - производные арилпропионовой кислоты (нитрил миндальной кислоты, ибупрофен амид) с образованием энантиомеров.
• Проведены патентные исследования. «Биокаталитические технологии и микроорганизмы-продуценты ферментов для синтеза органических кислот и энантиомерно-чистых соединений». На основе анализа выявленных патентов установлено, что для Российской Федерации являются перспективными для патентования и внедрения следующие направления:
1) новые, более технологичные штаммы для синтеза амидов и солей органических кислот;
2) способы биокаталитического получения и разделения энантиомеров, в том числе нестероидных противовоспалительных средств;
3) способы получения биокатализаторов и разработки, направленные на усовершенствование биокаталитических процессов.
В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют патенты, связанные со способами биокаталитического получения и разделения энантиомеров, в том числе нестероидных противовоспалительных средств.
Это свидетельствует о большом значении разработок, выполняемых в по теме данного проекта, для Российского рынка фармпрепаратов.
2.2. Новизна применяемых решений в сравнении с другими работами, родственными по тематике и целевому назначению и определяющими мировой уровень.
Для получения иммобилизованных биокатализаторов были использованы новые для этих процессов носители и режимы. Показана значительная стабилизация каталитических свойств биокатализаторов по сравнению со свободносуспендированной формой, используемой на многих зарубежных предприятиях, а также на предприятии ООО «Ашленд-МСП», г. Пермь, производящей биокаталитическим путем акриламид и акрилат в России. В отличие от применяемых на них гомогенных методов синтеза, иммобилизация позволяет использовать биокатализаторы повторно или более длительно, а также получать продукты синтеза более высокой чистоты без значительных затрат на процедуры разделения и очистки. Применяемые методы иммобилизации просты в исполнении и используют дешевые материалы, доступные по цене для промышленного производства.
2.3. Особенности исследования, разработки, метода или методологии проведения работы на отчетном этапе.
На отчетном этапе применялись современные способы и новые материалы для иммобилизации целых клеток и ферментных препаратов, в том числе методы адсорбционной иммобилизации с использованием активных углей и новых препаратов носителей на основе углеродных материалов и оксида алюминия, включение клеток в структуру гелей. Для выявления бактерий, трансформирующих энантиомеры и стерически затрудненные ароматические субстраты были использованы традиционные методы скрининга и селекции, а также молекулярно-генетические исследования, включающие ПЦР-анализ, секвенирование ДНК и др. Идентификацию бактерий осуществляли методами полифазной таксономии, а также с помощью анализа генов 16S РНК. Для детекции генов ферментов, трансформирующих исследуемые вещества, применяли методы ПЦР-анализа со специфическими праймерами и секвенирование. Измерение активности катаболических ферментов и детекцию продуктов биотрансформации анализировали методами спектрофотометрии, газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии. Для разделения и определения стереоизомеров были приобретены и использованы хиральные ВЭЖХ-колонки ВЭЖХ CHIRALCEL-OD-H, CHIRALCEL-OD, CROWNPAK® CR(+), CROWNPAK® CR(-).
2.4. Объекты интеллектуальной собственности, созданные на отчетном этапе.
Разработана питательная среда для селективного выделения и культивирования нокардиоформных каталитически активных актинобактерий и способ выделения каталитически активных актинобактерий. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, касается питательной среды для культивирования актинобактерий и может быть использовано для селективного выделения из окружающей среды (почвенных, водных и других образцов) актинобактерий, трансформирующих различные органические соединения, селекции, культивирования, изучения культурально-биохимических и генотипических свойств культур актинобактерий, получения активной биомассы для последующего биокаталитического применения в иммобилизованном виде. Составлена заявка на изобретение.
3. Области и масштабы использования полученных результатов
3.1. Области применения полученных результатов (области науки и техники; отрасли промышленности и социальной сферы, в которых могут использоваться полученные результаты или созданная на их основе инновационная продукция).
Результаты НИР могут быть использованы на базе новых или имеющихся мощностей по производству мономеров и полимерных материалов на их основе, на предприятиях химической промышленности г. Перми и Пермского края, других регионов Российской Федерации. Биокатализаторы для синтеза энантиомеров позволят производить нестероидные противовоспалительные средства для фармацевтической промышленности, такие как напроксен и ибупрофен.
Иммобилизованные биокатализаторы могут быть использованы для синтеза мономеров для полимерной химии на действующих предприятиях, специализирующихся на производстве акриламида, акрилата и полимеров из них. В отличие от применяемых на них суспензионных методов синтеза, иммобилизация позволяет использовать биокатализаторы повторно или более длительно, а также получать продукты синтеза более высокой чистоты без значительных затрат на процедуры разделения и очистки. Разрабатываемые биокатализаторы также могут быть использованы очистки сточных вод и воздуха от загрязняющих органических кислот на предприятиях химической и нефтехимической промышленности.
Результаты НИР будут внедрены в образовательный процесс для подготовки квалифицированных специалистов в области промышленной биотехнологии, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и генетики, владеющих новейшими методами исследования и конструирования генетических систем, создания штаммов-продуцентов ферментов, применимых в химической и фармацевтической промышленности; создания биодеструкторов токсичных органических соединений для решения экологических проблем; обладающих знанием производственных процессов, используемых в промышленной и экологической биотехнологии.
Повышение уровня образования по тематике НИР должно обеспечить подготовку квалифицированных кадров по биотехнологическому профилю для учреждений и предприятий Пермского края и смежных регионов,
3.2. Ход практического внедрения полученных результатов.
Практического внедрения результатов в отчетный период не планировалось. Теоретические данные, элементы методологии и результаты использованы при чтении курса лекций «Введение в биотехнологию», 3-й курс, биологи, ПГУ.
3.3. Оценка или прогноз влияния полученных результатов, товаров и услуг, созданных на основе полученных результатов, на подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, достижение или превышение заданных индикаторов и показателей.
Селекционированные штаммы, составляющие рабочую коллекцию, перспективны для применения в биокаталитических процессах. На дальнейших этапах выполнения проекта рабочая коллекция будет использована для получения штаммов, наиболее активных в отношении целевых биокаталитических реакций и для создания биокатализаторов.
С целью подготовки высококвалифицированных специалистов в области промышленной биотехнологии, нанобиотехнологии, молекулярной биологии и генетики и их закрепления в сфере науки, образования и современных технологий, сформирован научно-исследовательский коллектив, включающий 44 молодых сотрудников. К выполнению проекта привлечены 8 молодых специалистов-кандидатов наук, 5 аспирантов, 27 студентов кафедр ботаники и генетики растений, микробиологии и иммунологии, физиологии растений и микроорганизмов биологического факультета ПГУ и 1 студент механико-математического факультета ПГУ.
Запланированные работы и требования, заложенные в техническом задании, выполнены. Планируемые на 2010 г. индикаторы и показатели в части участия в конференциях и публикаций будут выполнены на 3-м этапе работы. Поданы необходимые заявки. Временное снижение количества молодых специалистов-кандидатов наук связано с достижением на данном этапе 35-летнего возраста. К концу отчетного годового периода их количество будет восполнено за счет запланированных защит 2-х аспирантов (Тихомирова, Костина) и 1 соискателя.
4. Выводы
4.1. Разработанные на этапе методы иммобилизации бактериальных клеток продуцентов позволят получать стабильные биокатализаторы для гетерогенного катализа, в том числе стереоспецифичные, способные работать в течение 4 и более циклов биокаталитических реакций без значительного снижения активности.
4.2. Исследованные методы иммобилизации ферментов на препаратах сапропеля приводят к стабилизации их структуры, повышению термостабильности (сдвиг пика активности более чем на 10°С), стабильности при хранении и срока действия (способность работать в течение 5 и более циклов биокаталитических реакций).
4.3. Разработанные методики иммобилизации отличается эффективностью и простотой в исполнении, основаны на использовании материалов (на основе углеродных материалов, полисахаридов агара, оксида алюминия) коммерчески доступных для применении в промышленных масштабах.
4.4. Отобранные каталитически-активные штаммы микроорганизмов способны активно трансформировать стерически затрудненные сложные ароматические субстраты (производные бензойной и фталевой кислот, бифенилы, а также новые штаммы бактерий, способные к активной биотрансформации арилпропионовых производных – нитрила миндальной кислоты и ибупрофенамида с образованием энантиомеров.
4.5. Проведен патентный поиск, выявивший, что настоящее время в Российской Федерации отсутствуют патенты, связанные со способами биокаталитического получения и разделения энантиомеров, в том числе нестероидных противовоспалительных средств. Для России являются перспективными для патентования и внедрения следующие направления: (1) способы биокаталитического получения и разделения энантиомеров, в том числе нестероидных противовоспалительных средств; (1) новые, более технологичные штаммы для синтеза амидов и солей органических кислот; (3) способы получения биокатализаторов и разработки, направленные на усовершенствование биокаталитических процессов.
4.6. Разработана питательная среда для селективного выделения и культивирования нокардиоформных каталитически активных актинобактерий и способ выделения каталитически активных актинобактерий. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, касается питательной среды для культивирования актинобактерий и может быть использовано для селективного выделения из окружающей среды (почвенных, водных и других образцов) актинобактерий, трансформирующих различные органические соединения, селекции, культивирования, изучения культурально-биохимических и генотипических свойств культур актинобактерий, получения активной биомассы для последующего биокаталитического применения в иммобилизованном виде.
4.7. С целью подготовки высококвалифицированных молодых специалистов и их закрепления в сфере науки, образования и современных технологий к выполнению проекта привлечены 44 молодых сотрудников, в том числе 8 молодых
специалистов-кандидатов наук, 5 аспирантов, 27 студентов биологического и 1 студент механико-математического факультетов ПГУ.

Получены биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток с использованием в качестве носителей углеродных материалов, в т.ч. на основе нанослоев. Данные биокатализаторы позволяют получать продукты биокатализа в чистом виде за счет гетерогенного катализа, способные длительно работать в непрерывном (проточном) или в периодическом (в течение 3-8 циклов биокаталитических реакций) режиме без значительного снижения активности, что приводит к повышению выхода продукта биотрансформации в пересчете на единицу массы биокатализатора.
Разработан способ получения иммобилизованных препаратов регио- и стереоселективных ферментов с использованием пористых углеродных материалов и носителей с синтезированными нанослоями углерода. Использованные носители обеспечивают высокий уровень адсорбции со стабилизации ферментативных активностей. Установлено, что адсорбция на углеродных и углеродсодержащих носителях приводит к стабилизации структуры ферментов, повышению термостабильности (повышение максимума активности более чем на 10°С), технологической стабильности и стабильности при хранении.
Получены частично очищенные ферментные препараты для биокатализа с использованием простых методов разрушения клеток и фракционирования бесклеточного экстракта, применимых в промышленных условиях.

Разработана методика получения биокатализатора для биотрансформации производных органических кислот и лабораторная технология синтеза энантиомеров производных арилпропионовых кислот
иммобилизации активных бактериальных клеток продуцентов ферментов, трансформирующих сложные субстраты, в том числе стереоселективные. Получены стабильные биокатализаторы для гетерогенного катализа, способные работать в течение 4 и более циклов биокаталитических реакций без значительного снижения активности.
Проведено моделирование аппарата для биотрансформации и синтеза энантиомеров.
Аппарат включает колоночный реактор, систему ввода раствора субстрата и вывода продуктов реакции, систему фильтрации и отделения реакционной среды, разделение продукта и энантиомера субстрата для последующей рацемизации последнего и направлении в рецикл.
Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс.
Подготовлена заявка на патент на изобретение.

Разработка лабораторной технологии
получения препарата нестероидного
противовоспалительного средства
напроксен.
Разработка лабораторной технологии
получения препарата нестероидного
противовоспалительного средства
ибупрофен.
Технико-экономическая оценка
результатов НИР.
Разработка лабораторной технологии
контроля аутентичности
энантиомеров при
биокаталитическом получении.