Регистрация / Вход
Прислать материал

Изучение процессов дифференцировки клеток с использованием методов системной биологии и создание алгоритма моделирования процесса дифференцировки

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.5006
Организация
ИБМХ
Руководитель работ
Згода Виктор Гаврилович

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
20.07.2009 - 30.09.2009
В качестве основного объекта исследования была получена линия клеток HL-60, пригодная для проведения исследований процесса дифференцировки. По результатам анализа литературных данных были выбраны индукторы ее дифференцировки и временные точки, которые будут использованы в последующих транскриптомных, протеомных и метаболомных исследованиях и предложена первоначальная схема проведения исследования. Также проведены предварительные эксперименты, позволяющие оценить в целом возможность проведения дифференцировки клеточной линии HL-60 и однородность популяции дифференцированных клеток.
Разработана методика с использованием стандартной схемы проведения транскриптомного анализа, которая дополнена методикой повторного использования экспрессионных микрочипов. Данная методика обеспечивает полномасштабный анализ мРНК на чипе, содержащем полноразмерный геном человека, и она представлена в виде протокола проведения транскриптомных исследований процесса дифференцировки клеточной линии HL-60.
В результате анализа литературных данных и проведения собственных экспериментов было проведено сравнение основных методов протеомного анализа, используемых на сегодняшний день. В результате сравнения была выбрана наиболее подходящая платформа для протеомного анализа клеточной линии млекопитающих, на основе которой была разработана методика проведения экспериментальных протеомных исследований процесса дифференцировки. Данная методика позволяет получить данные с максимальным количеством идентифицированных белков и воспроизводимостью с разрешением не менее 7500 при чувствительности 10-9M по БСА (бычьему сывороточному альбумину) в качестве стандарта.
На основе анализа стандартных методик метаболомных исследований с учетом имеющегося у коллектива исполнителей оборудования и необходимости в высокой производительности анализа была разработана методика проведения экспериментальных метаболомных исследований, пригодная для работы с клетками млекопитающих (клеточной линией HL-60). Данная методика основана на методе сравнения метаболомных отпечатков и обеспечивает получение данных с разрешением не менее 5000 при чувствительности 10 пикограмм по резернину в качестве стандарта. Разработанная методика метаболомных исследований представлена в виде протокола проведения экспериментальных метаболомных исследований, пригодного для изучения процессов дифференцировки.
Развернуть
2
01.10.2009 - 12.12.2009
На 2 этапе коллективом исполнителей были проведены экспериментальные исследования транскриптома, протеома и метаболома клеток линии HL-60 в процессе их дифференцировки в строгом соответствии с техническим заданием и календарным планом.
Контроль процесса дифференцировки получаемых клеток линии HL-60 осуществляли с использованием флуоресцентно-меченных к поверхностным маркерам антител.
С использованием разработанной на первом этапе методики проведения транскриптомного анализа проведен полногеномный анализ экспрессии генов в процессе дифференцировки клеточной линии HL 60, который позволил выявить достоверные различия в экспрессии большого количества генов. Уже через 30 минут после добавления активатора дифференцировки более чем в два раза усилилась экспрессия 134 генов, многие из которых могут играть ключевую роль в регуляции процессов, приводящих к смене физиологии и морфологии клетки. При этом 59 генов из этой группы показали достоверное усиление транскрипции только в данной временной точке. Дальнейший анализ показал двукратное повышение экспрессии для 207, 364, 393 и 1197 генов через 60 минут, 3 часа, 24 часа и 96 часов соответственно. По всей видимости, определенная часть генов из последней группы (96 часов) представлена факторами апоптоза.
Для протеомного анализа образцов клеток линии HL60, приготовленных в разное время после индукции процесса дифференцировки транс-ретионевой кислотой, использовали разработанную ранее методику проведения протеомных исследований. В ходе работы получены протеомные профили клеток в различных стадиях дифференцировки после добавления транс-ретиноевой кислоты. Показано, что подготовка пробы и разработанные условия анализа показывают хорошую воспроизводимость. Использование разработанных ранее протеомных протоколов 3D LC-MS/MS позволило провести идентификацию белков, концентрация которых составляет, согласно литературным данным менее 10-9М, при этом разрешающая способность Q-TOF масс-спектрометра при анализе пептидов составляла более чем 7000. Показано, что большинство белков не изменяет свою масс-спектрометрическую интенсивности во время дифференцировки, однако те белки, содержание которых достоверно изменяется со временем после индукции, представляют биологически ценную информацию. Обнаружено 13 белков, по которым найдены количественные отличия. Данные белки были идентифицированы методами тандемной масс-спектрометрии и 3D LC-MS/MS и они представляют интерес в качестве участников качественного и количественного динамического изменения протеомного профиля во время дифференцировки клеток HL60.
В ходе метаболомных исследований по разработанной на первом этапе методике анализа метаболома на данном этапе проведен хромато-масс-спектрометрический анализ низкомолекулярных соединений экстрагированных из двух серий образцов клеток выделенных в разные моменты времени после добавления транс-ретиноевой кислоты. Получены метаболомные профили представляющие совокупность сигналов комплекса низкомолекулярных соединений в образцах, и содержащий около 2000 соединений каждый. Подготовка пробы и хромато-масс-спектрометрический анализ достаточно воспроизводим для нормализации и математической обработки полученных результатов. Обнаружено 3619 соединений, интенсивность пиков которых не меняется в процессе дифференцировки. С другой стороны, было найдено 89 соединений, количество которых уменьшается и 68 соединений, концентрация которых увеличивается в процессе дифференцировки.
Развернуть
3
01.01.2010 - 31.05.2010
На третьем этапе НИР «Разработка алгоритмов моделирования и экспериментальная проверка» был разработан подход анализа экспериментальных данных транскриптомных, протеомных и метаболомных исследований на основе адаптированного алгоритма для выявления и анализа сетей, регулирующих сигнальную трансдукцию и метаболизм в специализированных клетках высших млекопитающих, проведен анализ регуляторных областей групп генов, демонстрирующих значимые изменение уровня экспрессии при процессе дифференцировки. Объединение и сравнение данных по изменению транскриптома с данными по анализу протеома и метаболома позволило идентифицировать транскрипционные факторы, потенциально задействованные в процессе дифференцировки. Также на данном этапе выявлены ключевые элементы регуляторной сети и сформулирована гипотеза об их роли в механизмах клеточной дифференцировки, после чего экспериментальными методами данная гипотеза была подтверждена.
Первоначально был разработан подход для анализа и интеграции данных, полученных при транскриптомных, протеомных и метаболомных исследований процесса дифференцировки клеток. Используемый для этого алгоритм представляет собой адаптацию существующих подходов поиска предполагаемых сайтов связывания транскрипционных факторов и выявления ключевых элементов путей сигнальной трансдукции, который также учитывает ауторегуляторные петли в регуляции клеточной дифференцировки. Адаптированный алгоритм компьютерного моделирования процесса дифференцировки, основанный на экспериментальных данных транскриптомных, протеомных и метаболомных исследований, позволяет анализировать регуляторные области групп генов, демонстрирующих значимые изменение уровня экспрессии при процессе дифференцировки, а также выявлять ключевые элементы регуляторной сети при процессе дифференцировки.
По результатам функционального анализа данных транскриптомных исследований были выделены две основные группы, представляющие интерес с точки зрения регуляции дифференцировки клеток HL-60 в нейтрофилы под воздействием ATRA, а также наиболее оптимальные временные точки для сопоставления транскриптомных, протеомных и метаболомных данных. С использованием адаптированного алгоритма проведен анализ регулятроных областей групп генов с изменой экспрессией и выявлены транскрипционные факторы, которые по литературным данным действительно вовлечены в дифференцировку миелоидных клеток.
Далее при сравнении и объединении данных транскриптомных, протемоных и метаболомных исследований были обнаружены факторы транскрипции, которые совпадают при анализе регуляторных областей групп генов, полученных в ходе транскриптомного анализа, генов белков с измененной экспрессией, полученных в ходе протеомных исследований и генов белков, которые участвуют в химических превращениях метаболитов, полученных в ходе метаболомных исследований. Наличие таких совпадающих транскрипционных факторов в регуляторных сетях, позволил определить путь, по которому может осуществляться сигнальная трансдукция и это может служить независимым подтверждением выработанных гипотез о механизмах регуляции изучаемых процессов дифференцировки.
В ходе дальнейшего анализа полученных транскрипционных факторов выявлены ключевые молекулы в регуляторной сети в каждой временной точки, которые являются важными в процессе дифференцировки в ответ на воздействие ATRA, причем поиск происходил с учетом данных по протеомике и метаболомике. Сравнение и анализ выявленных ключевых молекул и регуляторных цепей, в которых они присутствуют, показывает «вложенность» и пересечение путей сигнальной трансдукции при процессе дифференцировки. Дополнительным независимым подтверждением участия именно обнаруженных ключевых молекул и регуляторных путей в процессе дифференцировки HL-60 при воздействии ATRA могут служить данные транскриптомного анализа, показывающие изменение экспрессии не только ТФ в данных сетях (с-myc, c-Jun, с-myb и др.) но и некоторых других молекул (LynA, Cbl и др.), включая ключевые элементы (p62Dok-1, SHP1, MEKK3). Причем увеличение экспрессии SHP1 (протеинтирозинкиназа нерецепторного типа 6) показано как при транскриптомном, так и протеомном анализе. Полученные в различные временные точки процесса дифференцировки ключевые элементы и их графическое представление в виде регуляторных сетей позволили сформулировать гипотезу относительно индуцируемой ATRA дифференцировки клеток HL-60 в нейтрофилы. Предположено, что при индукции процесса дифференцировки клеток HL-60 при помощи ATRA уже в первые часы обнаруженные ключевые элементы опосредуют активацию активации пути передачи сигнала Jak-STAT, который в последующие временные точки также находит отражение в регуляторных сетях. В 3 часа индуцируемой дифференцировки TC-PTP приводит к активации пути, тормозящему процессы пролиферации клеток. В 24 часа активация процессов дифференцировки становится более выраженной за счет дополнительной стимуляции коактиваторов СВР и р300, и модуляции пути митогенактивируемых протеинкиназ. В ходе всего процесса дифференцировки наиболее важными ключевыми молекулами являются протеинтирозинфосфотазы (TC-PTP и SHP-1).
В ходе проверки предложенной гипотезы и подтверждения полученных результатов на уровне транскрипции (ПЦР в реальном времени) и белковом уровне (MRM) доказана важность протеинтирозинфосфотазы нерецепторного типа 6 (SHP-1) , а также активация пути Jak-STAT. Верификацию метаболомных результатов проводили на основе положительного контроля, которым в нашем случае являлась ретиновая кислота. Нахождение и правильная идентификация ретиноевой кислоты может служить подтверждением для положительной идентификации других соединений.
Развернуть
4
01.06.2010 - 04.09.2010
На 4 этапе НИР доработан алгоритм для построения наиболее полной предсказательной модели процесса дифференцировки гранулоцитов и макрофагов. В результате использования такого доработанного подхода были получены более полные регуляторные сети путей передачи сигнала при индуцированной ATRA дифференцировке клеток HL-60, что позволяет выявить ключевые элементы, ответственные за процессы блокировки пролиферации и активации дифференцировки на ранних стадиях дифференцировки клеток HL-60 (до 3 часов). Проведены патентные исследования. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс. Проведен научный семинар «Моделирование процессов дифференцировки клеток», подготовленный приглашенным исследователем. Результаты НИР частично были представлены в докладах на 5 международной конференции "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine" Санкт-Петербург - Кижи - Валаам - Коневец - Санкт-Петербург, Россия, 31 мая – 5 июня 2010 г.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.5 Проведение научных исследований коллективами под руководством приглашенных исследователей
Продолжительность работ
2013, 6 мес.
Бюджетные средства
5 млн
Организация
ИОГен РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2008 - 2009, 16 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Организация
ИБГ РАН
профинансировано
Тема
Разработка метода управления нейральной дифференцировкой стромальных клеток жировой ткани.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
3
Тема
Механизмы направленной миграции и дифференцировки аутологичных прогениторных клеток при регенерации поврежденных тканей.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка методов получения и направленной дифференцировки резидентных стволовых или индуцированных плюрипотентных клеток.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
9
Тема
Разработка комплекса программных компонентов для компьютерного моделирования и дизайна в области постгеномной системной биологии (системная биология in silico)
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
70 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка способов направленной нейрональной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, исключающих клетки с генетическими изменениями и/или туморогенным потенциалом.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
3