Разработка тест-системы для выявления и анализа лекарственной устойчивости инфекционных агентов, приводящих к нарушениям репродуктивных функций.

Проведен сбор и обработка клинического материла и формирование коллекции ДНК клинических образцов и чистых культур возбудителей ИПНРФ, чувствительных или устойчивых к ципрофлоксацину, пенициллину, спектиномицину, цефтриаксону, доксициклину, метронидазолу, азитромицину, тетрациклину. Проведен анализ нуклетидных последовательностей полных геномов, плазмид и фрагментов геномов возбудителей ИПНРФ, с целью выбора мишеней для идентификации и установления детерминант лекарственной устойчивости. Определены гены-мишени 16S рРНК и gyrB для идентификации всего спектра возбудителей ИПНРФ. Выбраны мишени-кандидаты в геномах возбудителей ИПНРФ, ассоциированные с лекарственной устойчивостью. Проведено таргетное секвенирование 350 образцов ДНК возбудителей ИПНРФ. Сконструированы последовательности СР-1 - видоспецифичные олигонуклеотидные зонды и праймеры для амплификации фрагменты генов 16S рРНК и gyrB. Синтезирован комплект СР-1. Проведено конструирование, синтез и очистка синтетических фрагментов ДНК (СФ-1) для проверки специальных реагентов СФ-1 в ходе испытаний. Разработаны и изготовлены ДНК-чипы (в количестве 2600 ед.), содержащие иммобилизованные олигонуклеотиды из состава СР-1, последовательности которых специфичны к фрагментам генов 16S рРНК и gyrB. Разработана и согласована Программа и методики испытаний ПМ-СР-1-01. Проведены испытания СР-1 с использованием синтетических фрагментов ДНК, образцов ДНК возбудителей ИПНРФ. По результатам испытаний отобраны олигонуклеотиды и праймеры, специфичные к фрагменту гена 16S рРНК. Для данных СР-1, прошедших испытаний составлена спецификация РТСИ 941119.007.001.000.

Конструирование и синтез специальных реагентов (олигонуклеотидов и праймеров) для идентификации генетических детерминант резистентности возбудителей ИПНРФ (СР-2) по результатам таргетного секвенирования.
  Конструирование и синтез синтетических фрагментов ДНК (СФ-2) с целью проверки СР-2.
  Разработка и изготовление ДНК-чипов, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды из состава СР-2.
  Сбор и обработка клинического материала для коллекции (часть II);
  Разработка Программы и методик испытаний СР-2;
  Проведение испытаний СР с использованием синтетических фрагментов ДНК СФ-2, образцов из сформированной коллекции;
  Отбор СР-2 по результатам испытаний, корректировка СР (при необходимости).

Завершены работы по конструированию и оптимизации специальных реагентов, компонентов реакций амплификации (АМ) и гибридизации (ГБ) на ДНК-чипе, процедур анализа геномов возбудителей ИПНРФ, включая методы амплификации, гибридизации и интерпретации результатов. Составлены спецификации комплектов АМ, ГБ и контрольного образца КО. Реализация разработанных методик и спецификаций в составе макета тест-системы с последующими испытаниями позволит создать продукт для персонализированной диагностики in vitro возбудителей ИПНРФ. Завершен сбор и обработка клинического материала возбудителей ИПНРФ. Проведены дополнительные патентные исследования, подана заявка на патент РФ. Сформирована коллекция образцов ДНК возбудителей ИПНРФ, охарактеризованная микробиологическими, молекулярно-генетическими методами, а также с использованием масс-спектрометрии. Характеризация образцов проводилась, в т.ч., методами таргетного и метагеномного секвенирования в ЦКП «Геном» ИМБ РАН. Коллекция, насчитывающая суммарно, 300 образцов ДНК, готова для проведения испытаний макетов тест-системы. Контроль качества ДНК-чипов выполнен индустриальным партнером проекта. Индустриальным партнером проекта проведена также первичная оценка нормативов при производстве комплектов реагентов и ДНК-чипов, входящих в тест-систему.

Разработана техническая документация (ТД) на макет тест-системы ВИЗОР-ТЕСТ для идентификации возбудителей инфекций, приводящих к нарушению репродуктивных функций (ИПНРФ) с одновременным определением генетических детерминант устойчивости, включая чертеж общего вида, лабораторный технологический регламент, проект инструкции по применению. Изготовлено 50 макетов тест-системы. Проведены лабораторные испытания согласно разработанным программе и методикам испытаний.

Разработана техническая документация на тест-систему ВИЗОР-ТЕСТ (проект инструкции по пользованию, пояснительная записка, чертеж общего вида, лабораторный технологический регламент), согласно которой изготовлено 200 макетов тест-системы для проведения лабораторных и клинико-лабораторных испытаний. Проведены лабораторные и клинико-лабораторные испытания с использованием более 300 образцов ДНК возбудителей ИПНРФ, показавшие соответствие ключевых параметров тест-системы требованиям ТЗ Соглашения. По итогам испытаний диагностические чувствительность и специфичность тест-системы при идентификации возбудителей ИПНРФ составили не менее 95%, а диагностические чувствительность и специфичность при идентификации генетических детерминант устойчивости не менее 90%. Подготовлен проект ТЗ на ОКР.