Регистрация / Вход
Прислать материал

Клеточная терапия генетически модифицированными стволовыми клетками пуповинной крови трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофического склероза

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2052

Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам.
Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне.
Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.

Этапы проекта

1
27.02.2007 - 30.06.2007
Произведен анализ литературы и патентные исследования по молекулярным и клеточным аспектам трансфекции клеток пуповинной крови и использованию генетически модифицированных клеток в лечении нейродегенеративных заболеваний. Создана рабочая исследовательская группа (22 человека). Произведены закупки оборудования. Отработаны методы получения мононуклеаров из пуповинной крови, а также методы трансфекции и варианты доставки клеток непосредственно в ЦНС. Через питомник лабораторных животных «Пущино» приобретены генетически модифицированные G93A мыши. В питомнике получено потомство, сформированы ядра и проведено их генотипирование. Выбрано направление исследований. Исследовательская группа готова к выполнению 2 этапа «Экспериментальные исследования».
Развернуть
2
01.07.2007 - 30.09.2007
В ходе выполнения второго этапа работ были проведены экспериментальные исследования по отработке и поиску оптимальных методов получения чистой фракции мононуклеаров из пуповинной крови человека. Параллельно, исходя из задач исследования, в полном объеме были проведены работы в области генной инженерии (дизайн праймеров, клонирование и секвенирование), наработаны препаративные количества плазмид для трансфекции мононуклеаров. Проведен анализ эффективности нуклеофекции методом электропарации и липофильной трансфекции, в результате которого было установлено, что более эффективным является метод электропарации, и отработаны оптимальные условия проведения трансфекции. Нативные и генетически модифицированные клетки, трансфецированные генами EGFP и L1CAM+VEGF, трансплантировали мышам G93A c фенотипом бокового амиотрофического склероза и крысам после частичной гепатэктомии. Ксенотрансплантация нативных и генетически модифицированных мононуклеаров не вызывала посттрансплантационных осложнений и реакции отторжения трансплантата. Проводится оценка терапевтического эффекта, в частности хоуминга и дифференцировки трансплантированных клеток у крыс. С целью выявления терапевтического эффекта трансплантации на продолжительность жизни G93A мышей животные будут выведены из эксперимента в терминальной стадии болезни с последующим анализом хоуминга и дифференцировки трансплантированных клеток. Экспериментальные исследования второго этапа НИР подтверждают правильность выбранного направления исследования и перспективы разработки методов клеточной терапии генетически модифицированными мононуклеарами пуповинной крови.
Подана заявка и объявлены торги на конкурсной основе на приобретение материалов (реактивы). Оплата товаров по данной заявке будет проведена после завершения торгов, объявления результатов конкурса и заключения контракта с фирмой-победителем. Информация по торгам размещена на сайте www.zakupk.gov.ru
Согласно договору № 249/07-Т от 18 июля 2007 г. проведена оплата услуг питомника лабораторных животных «Пущино» при филиале института биоорганической химии РАН за разведение и генотипирование трансгенных G93A мышей.
Развернуть
3
01.10.2007 - 31.10.2007
1) Проведены патентные исследования и анализ литературы с использованием всех открытых Российских и международных баз данных научной литературы и баз данных патентных организаций США, Европы, Японии, Канады и других стран. Результаты исследований позволили заключить, что выбранное направление исследований является инновационным и имеет высокие шансы на получение патентоспособных интеллектуальных и практических разработок с последующей возможностью внедрения в клиническую практику для лечения нейродегенеративных заболеваний человека.
2) Были отработаны оптимальные методы выделения фракции мононуклеаров, содержащей стволовые клетки, из свежеполученной и криконсервированной пуповинной крови. Экспериментально было установлено, что из всех существующих методов процессинга пуповинной крови наилучшим методом для получения чистой и пригодной для дальнейшей трансфекции фракции мононуклеаров является выделение в градиенте плотности фиколла. Установлено, что криоконсервированные и свежевыделенные клетки могут быть одинаково эффективно использованы для проведения генетической модификации.
3) Одновременно были проведены работы в области генной инженерии (дизайн праймеров, клонирование и секвенирование). В результате были наработаны препаративные количества различных плазмид для трансфекции мононуклеаров.
4) На следующем этапе был проведен анализ эффективности различных методов трансфекции (химических – с трансфекционными реагентами Escort V (Sigma) и TransFast (Promega) и электрического – электропорация). Эффективность различных методов трансфекции определяли по экспрессии трэйсерного гена – ЕGFP. Во всех апробированных методах процент выхода трансфецированных клеток находился в диапазоне от 20 до 30%, и обнаружить какую-либо разницу или преимущества нам не удалось. В то же время, все дальнейшие исследования мы проводили, используя метод электропорации, основным преимуществом которой является сведение биологической вредности к минимуму по сравнению с вирус-опосредованной и химической передачей гена.
5) Через питомник лабораторных животных «Пущино» Казанский ГМУ впервые в России приобрёл трансгенных G93A мышей, экспрессирующих фенотип бокового амиотрофичесого склероза. В питомнике получено потомство и сформированы ядра. Все животные до начала экспериментов по трансплантации клеток в ретробульбарное пространство прошли генотипирование.
6) Нативные и генетически модифицированные клетки, трансфецированные генами EGFP и L1CAM+VEGF, трансплантировали мутантным G93A мышам и крысам после частичной гепатэктомии. По экспрессии специфических антигенов человека и ЕGFP, ген которого трансфецировали в клетки, удалось проследить миграцию, хоуминг и дифференцировку трансплантированных клеток в органах мишенях (головной и спинной мозг, регенерирующая печень).
7) Оценка терапевтического эффекта с использованием поведенческих тестов у G93A мышей показала преимущества генетической модификации клеток пуповинной крови по сравнению с трансплантацией нативных клеток. Ксенотрансплантация нативных и генетически модифицированных мононуклеаров не вызывала посттрансплантационных осложнений и реакции отторжения трансплантата. На момент написания отчета все животные (как экспериментальной, так и контрольной группы) находятся на стадии начала развития мышечной слабости, поэтому результаты по влиянию трансплантации генетически модифицированных клеток на продолжительность жизни G93A мышей будут получены по мере гибели животных в терминальной стадии болезни.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"

Программное мероприятие

1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИОГен РАН
профинансировано
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Клеточные технологии»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
40
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области индустрии наносистем и материалов по критической технологии «Нанотехнологии и наноматериалы» (мероприятие 1.3 Программы)
Продолжительность работ
2007 - 2008, 11 мес.
Бюджетные средства
16 млн
Количество заявок
72
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
48
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных»
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
136
Тема
Работы по проведению проблемно-ориентированных поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области живых систем по критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» (мероприятие 1.2 Программы)
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
43