Получение и дифференциальное профилирование культур Т-регуляторных клеток человека, обладающих супрессорной активностью, индуцируемой раковыми или мезенхимальными стволовыми клетками

Целью первого этапа НИР явился поиск направления решения поставленной задачи, получение первичных культур раковых и мезенхимальных стволовых клеток и их фенотипический анализ. Для этой цели были проведены углубленный анализ литературы и патентный поиск. Кроме того, для определения оптимального пути решения поставленной задачи был проведен инструментальный анализ содержания Т-регуляторных (CD4+, CD25+) клеток у пациентов с различными формами рака. Было установлено наиболее высокое содержание этих клеток в крови пациентов с раком кишечника и почки. В связи с этим дальнейшие исследования будут сосредоточены на этих формах рака.
Проведен сбор клеточного материала от больных злокачественными опухолями. Определены фенотипические маркёры раковых и стволовых клеток, которые могут быть использованы для идентификации и разделения искомых популяций. Получены первичные клеточные культуры мезенхимальных стволовых и опухолевых клеток.
Полученные результаты будут использованы для проведения следующего этапа работ, а так же могут быть использованы для разработки клинических тестов, позволяющих прогнозировать течение онкологических заболеваний.

На отчетном этапе основные усилия были сосредоточены на получении Т-регуляторных клеток в культуре и их транскриптомном анализе. Т-лимфоциты с фенотипом CD4+ CD25- и CD4+ CD25+ были выделены из крови онкологических больных раком кишечника и раком почки. Регуляторная природа CD4+ CD25+ клеток была показана в экспериментах по выявлению экспрессии фактора транскрипции FoxP3 и маркера CD127, а также способности подавлять пролиферацию CD4+ CD25- клеток. Был разработан протокол индукции регуляторного фенотипа мезенхимальными стволовыми клетками. Образующиеся в культуре лимфоциты обладали высокой регуляторной активностью, но отличались от выделенных из крови Т-регуляторных клеток по секреции цитокинов и экспрессии FoxP3 и CD25. Из клеток, экспрессирующих регуляторный фенотип, была выделена РНК, которая затем была проанализирована на микрочипах фирмы Agilent для выявления профиля генной экспрессии.

На отчетном этапе были проанализированы данные по экспрессии генов в клетках культур с регуляторной активностью, полученных на предыдущем этапе. Для повышения уровня достоверности результатов на этом этапе также был выполнен эксперимент «Dye swap» при, котором, на одном микрочипе гибридизуется РНК контрольных и исследуемых клеток, содержащая различающиеся флуоресцентные метки.
Были определены гены, экспрессируемых преимущественно в CD4+ CD25+ клетках и выделена группа из 37 генов, уровень экспрессии которых более чем в два раза превышает таковой в клетках с Т-хелперным фенотипом. Анализ этой группы подтвердил наличие известных маркеров регуляторных клеток человека, таких как CTLA4, FOXP3, CD25, CCR7 а также TNFRSF1B. Кластеризация генов/протеинов при помощи биоинформационного ресурса DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) позволила определить их основные функциональные категории. Установлено, что в исследуемых клетках преимущественно синтезируются трансмембранные протеины, белки, регулирующие процессы пролиферации и запрограммированной смерти клеток (апоптоза).
Был выявлен также ряд генов, включая гены с неизвестной функцией ранее не ассоциировавшиеся с Т-регуляторным фенотипом. Для одного их таких генов (A_24_P938583) было установлено сходство с геном TDP43, продукт которого является клеточным регулятором, действующим на уровне связывания с ДНК.