Получение и дифференциальное профилирование культур Т-регуляторных клеток человека, обладающих супрессорной активностью, индуцируемой раковыми или мезенхимальными стволовыми клетками
Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2063
Руководитель работ
Ярыгин Константин Никитич
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Внебюджетные средства
0,42 млн
Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам.
Создаваемый научно-технический задел должен обеспечивать в будущем проведение опытно-конструкторских и технологических работ на конкурентном уровне.
Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.
Соисполнители
Организация
ИБМХ
Этапы проекта
1
27.02.2007 - 31.05.2007
Целью первого этапа НИР явился поиск направления решения поставленной задачи, получение первичных культур раковых и мезенхимальных стволовых клеток и их фенотипический анализ. Для этой цели были проведены углубленный анализ литературы и патентный поиск. Кроме того, для определения оптимального пути решения поставленной задачи был проведен инструментальный анализ содержания Т-регуляторных (CD4+, CD25+) клеток у пациентов с различными формами рака. Было установлено наиболее высокое содержание этих клеток в крови пациентов с раком кишечника и почки. В связи с этим дальнейшие исследования будут сосредоточены на этих формах рака.
Проведен сбор клеточного материала от больных злокачественными опухолями. Определены фенотипические маркёры раковых и стволовых клеток, которые могут быть использованы для идентификации и разделения искомых популяций. Получены первичные клеточные культуры мезенхимальных стволовых и опухолевых клеток.
Полученные результаты будут использованы для проведения следующего этапа работ, а так же могут быть использованы для разработки клинических тестов, позволяющих прогнозировать течение онкологических заболеваний.
Проведен сбор клеточного материала от больных злокачественными опухолями. Определены фенотипические маркёры раковых и стволовых клеток, которые могут быть использованы для идентификации и разделения искомых популяций. Получены первичные клеточные культуры мезенхимальных стволовых и опухолевых клеток.
Полученные результаты будут использованы для проведения следующего этапа работ, а так же могут быть использованы для разработки клинических тестов, позволяющих прогнозировать течение онкологических заболеваний.
2
01.06.2007 - 30.09.2007
На отчетном этапе основные усилия были сосредоточены на получении Т-регуляторных клеток в культуре и их транскриптомном анализе. Т-лимфоциты с фенотипом CD4+ CD25- и CD4+ CD25+ были выделены из крови онкологических больных раком кишечника и раком почки. Регуляторная природа CD4+ CD25+ клеток была показана в экспериментах по выявлению экспрессии фактора транскрипции FoxP3 и маркера CD127, а также способности подавлять пролиферацию CD4+ CD25- клеток. Был разработан протокол индукции регуляторного фенотипа мезенхимальными стволовыми клетками. Образующиеся в культуре лимфоциты обладали высокой регуляторной активностью, но отличались от выделенных из крови Т-регуляторных клеток по секреции цитокинов и экспрессии FoxP3 и CD25. Из клеток, экспрессирующих регуляторный фенотип, была выделена РНК, которая затем была проанализирована на микрочипах фирмы Agilent для выявления профиля генной экспрессии.
3
01.10.2007 - 31.10.2007
На отчетном этапе были проанализированы данные по экспрессии генов в клетках культур с регуляторной активностью, полученных на предыдущем этапе. Для повышения уровня достоверности результатов на этом этапе также был выполнен эксперимент «Dye swap» при, котором, на одном микрочипе гибридизуется РНК контрольных и исследуемых клеток, содержащая различающиеся флуоресцентные метки.
Были определены гены, экспрессируемых преимущественно в CD4+ CD25+ клетках и выделена группа из 37 генов, уровень экспрессии которых более чем в два раза превышает таковой в клетках с Т-хелперным фенотипом. Анализ этой группы подтвердил наличие известных маркеров регуляторных клеток человека, таких как CTLA4, FOXP3, CD25, CCR7 а также TNFRSF1B. Кластеризация генов/протеинов при помощи биоинформационного ресурса DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) позволила определить их основные функциональные категории. Установлено, что в исследуемых клетках преимущественно синтезируются трансмембранные протеины, белки, регулирующие процессы пролиферации и запрограммированной смерти клеток (апоптоза).
Был выявлен также ряд генов, включая гены с неизвестной функцией ранее не ассоциировавшиеся с Т-регуляторным фенотипом. Для одного их таких генов (A_24_P938583) было установлено сходство с геном TDP43, продукт которого является клеточным регулятором, действующим на уровне связывания с ДНК.
Были определены гены, экспрессируемых преимущественно в CD4+ CD25+ клетках и выделена группа из 37 генов, уровень экспрессии которых более чем в два раза превышает таковой в клетках с Т-хелперным фенотипом. Анализ этой группы подтвердил наличие известных маркеров регуляторных клеток человека, таких как CTLA4, FOXP3, CD25, CCR7 а также TNFRSF1B. Кластеризация генов/протеинов при помощи биоинформационного ресурса DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) позволила определить их основные функциональные категории. Установлено, что в исследуемых клетках преимущественно синтезируются трансмембранные протеины, белки, регулирующие процессы пролиферации и запрограммированной смерти клеток (апоптоза).
Был выявлен также ряд генов, включая гены с неизвестной функцией ранее не ассоциировавшиеся с Т-регуляторным фенотипом. Для одного их таких генов (A_24_P938583) было установлено сходство с геном TDP43, продукт которого является клеточным регулятором, действующим на уровне связывания с ДНК.
Программа
Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"
Программное мероприятие
1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007, 8 мес.
Бюджетные средства
4,13 млн
Организация
ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России
профинансировано
профинансировано
профинансировано
профинансировано
профинансировано