Суицидная генотерапия гормон-чувствительных опухолей человека: разработка невирусной системы направленного переноса гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа на основе аналогов люлиберина

В результате выполнения первого этапа работ синтезированы три пептида, представляющих собой аналоги люлиберина (GnRH). На их основе получены два молекулярных конъюгата, содержащих помимо лигандной части модифицированный сигнал ядерной локализации T-антигена вируса SV-40 (NLS). Кроме того, получены два меченых с помощью флюоресцеина пептида. Показано, что основным путем интернализации молекулярных конъюгатов на основе люлиберина является рецептор-опосредованный эндоцитоз. Изучены условия формирования комплексов исследуемых молекулярных конъюгатов с плазмидной ДНК, в частности, изучена стехиометрия комплексов и показан некооперативный характер взаимодействия ДНК с пептидами. В экспериментах на клетках гепатомы человека HepG2 показано, что комплексы ДНК с молекулярными конъюгатами на основе GnRH способны эффективно проникать в клетки и обеспечивать экспрессию перенесенных генов. Параллельно проводилось исследование факторов, влияющих на эффективность переноса ДНК в опухолевые клетки млекопитающих с помощью исследуемых молекулярных конъюгатов. Показано, что в отличие от ранее изученных комплексов ДНК с катионными пептидами K8 и TAT, избытки свободных пептидов не оказывают существенного влияния на эффективность проникновения комплексов ДНК/NLS-GnRH в клетки HepG2. Выявлено угнетающее действие компонентов сыворотки крови на процесс интернализации комплексов клетками HepG2. Данное обстоятельство может иметь решающее значение в дальнейших исследованиях, связанных с разработкой методов доставки комплексов ДНК/GnRH-NLS in vivo.
Таким образом, выполнены основные задачи первого этапа НИР – синтезированы молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина, изучены условия их комплексообразования с плазмидной ДНК, показано, что основным механизмом интернализации комплексов ДНК/GnRH-NLS является рецептор-опосредованный эндоцитоз и выявлены факторы, влияющие на эффективность переноса ДНК в клетки

В результате выполнения НИР синтезированы 4 пептида, представляющих собой аналоги люлиберина (GnRH). На их основе получены три молекулярных конъюгата, содержащих помимо лигандной части модифицированный сигнал ядерной локализации T-антигена вируса SV-40 (NLS). Кроме того, получены три меченых с помощью флюоресцеина пептида. Показано, что основным путем интернализации молекулярных конъюгатов на основе люлиберина является рецептор-опосредованный эндоцитоз. Изучены условия формирования комплексов исследуемых молекулярных конъюгатов с плазмидной ДНК, в частности, изучена стехиометрия комплексов и показан некооперативный характер взаимодействия ДНК с пептидами. В экспериментах на клетках гепатомы человека HepG2 показано, что комплексы ДНК с молекулярными конъюгатами на основе GnRH способны эффективно проникать в клетки и обеспечивать экспрессию перенесенных генов. Параллельно проводилось исследование факторов, влияющих на эффективность переноса ДНК в опухолевые клетки млекопитающих с помощью исследуемых молекулярных конъюгатов. Показано, что в отличие от ранее изученных комплексов ДНК с катионными пептидами K8 и TAT, избытки свободных пептидов не оказывают существенного влияния на эффективность проникновения комплексов ДНК/NLS-GnRH в клетки HepG2. Выявлено угнетающее действие компонентов сыворотки крови на процесс интернализации комплексов клетками HepG2. Данное обстоятельство может иметь решающее значение в дальнейших исследованиях, связанных с разработкой методов доставки комплексов ДНК/GnRH-NLS in vivo. Осуществлен перенос вектора экспрессии гена тимидин-киназы вируса HSV1 в клетки HepG2 с помощью двух синтезированных молекулярных конъюгатов. Последующая обработка трансфецированных клеток ацикловиром привела к апоптотической гибели более 90% клеток.
Таким образом, выполнены основные задачи НИР – синтезированы молекулярные конъюгаты на основе аналогов люлиберина, изучены условия их комплексообразования с плазмидной ДНК, показано, что основным механизмом интернализации комплексов ДНК/GnRH-NLS является рецептор-опосредованный эндоцитоз и выявлены факторы, влияющие на эффективность переноса ДНК в клетки с помощью исследуемых молекулярных конъюгатов. На основе полученных конъюгатов разработана эффективная система переноса генов в клетки гормон-чувствительных опухолей человека. Данная система успешно апробирована на модели «суицидной» генотерапии клеток гепатомы человека HepG2.