Получение и совершенствование штаммов дрожжей Pichia pastoris – продуцентов высокоселективных лекарственных препаратов на основе альфа16-интерферона человека и химерного белка, состоящего из целевого белка и альбумина плазмы крови человека

Объектом исследования являлись штаммы дрожжей Pichia pastoris, синтезирующие альфа16 интерферон человека.
Цель работы заключалась в селекции спонтанно возникающих клонов интегрантов дрожжей Pichia pastoris, содержащих множественные встройки экспрессионной кассеты, что обеспечивает высокий и стабильный уровень продукции интерферона альфа 16 человека. В работе сознательно не применяли традиционный подход для получения мультикопийных интегрантов, заключающийся в использовании плазмид с генами устойчивости к антибиотикам и отборе трансформантов на средах с градиентом концентрации антибиотика.
В работе получены 2 клона дрожжей Pichia pastoris с повышенным уровнем синтеза и секреции интерферона альфа 16 человека по сравнению со штаммом, ранее защищенным патентом РФ.
Полученные штаммы дрожжей P. pastoris – продуценты рекомбинантного альфа16- интерферона могут быть использованы для производства рекомбинантных белков медицинского назначения в Центре малотоннажного производства медицинских биопрепаратов методами генной инженерии, включенного в Программу развития Петергофа как Наукограда РФ.

В процессе выполнения второго этапа, задачей которого являлось создание штаммов дрожжей P. pastoris - продуцентов химерного белка, состоящего из альфа16-интерферона и альбумина человека, впервые получено 30 клонов дрожжей P. pastoris с различным уровнем синтеза и секреции химерного белка, состоящего из целевого белка и альбумина человека. Полученные штаммы дрожжей P. pastoris – продуценты рекомбинантного химерного белка, состоящего из альфа16 интерферона и альбумина человека, могут быть использованы для производства рекомбинантных белков медицинского назначения.

В процессе выполнения научно-исследовательской работы проведена селекция штаммов дрожжей Pichia pastoris - продуцентов альфа16-интерферона человека и отобраны трансформанты, способные секретировать до 20-22 мг целевого продукта на литр культуральной среды, что на 40% превышает продуктивность штамма - прототипа.
При трансформации штамма дрожжей P. pastoris PS99 плазмидой pPIC9AbFN, обеспечивающей синтез химерного гетерологичного белка, состоящего из альбумина и альфа16-интерферона человека под контролем промотора гена АОХ1 дрожжей P. pastoris, были получены интегранты с различным уровнем синтеза и секреции химерного белка.
Отработана технология культивирования штаммов дрожжей – продуцентов альфа16-интерферона человека и химерного белка, состоящего из альбумина и альфа16-интерферона человека, разработана схема очистки рекомбинантных белков. Проведено определение биологической активности альфа16-интерферона человека и химерного белка, состоящего из альбумина и альфа16-интерферона человека, изучено влияние рН среды на стабильность и активность рекомбинантных белков. Проведены испытания рекомбинантного альфа16-интерферона человека на острую и хроническую токсичность.